Трансплантация эмбрионов

Таблица 4 – Стадии развития и качество эмбрионов в зависимости  от дня извлечения после осеменения коров – доноров

Стадия развития эмбрионов	День извлечения
	шестой	седьмой	восьмой	девятый
Общее количество эмбрионов	40	254	56	15
Морулы, %
Ранние	100	22,9	28,1	-
Поздние	-	54,1	31,3	20,0
Бластоцисты, %
Ранние	-	15,6	15,6	-
Поздние	-	7,4	25,0	80,0
В т.ч.: нормальные	37,5	53,1	57,2	33,3
Дегенерированные	10,0	36,6	19,6	6,7
Неоплодотворенные	52,5	10,3	23,2	60,0

 

4.2 Оценка качества эмбрионов  и их культивирование.

Оценку биологической  полноценности эмбрионов крупного рогатого скота можно проводить  несколькими методами: морфологически, с использованием фитальных красителей, культивированием. Наибольшее распространение  получил морфологический метод. Установлено, что результаты имплантации  зародышей зависят от того, насколько  полно оценена их жизнеспособность. Работу с эмбрионами проводят в стерильных условиях в специальном помещении - боксе при температуре воздуха + 22 - +25°С. 

Основными критериями, по которым  производится оценка качества эмбрионов, являются: определение стадии их развития, соответствие уровня дробления возрасту от оплодотворения до извлечения, целостность  и форма оболочки, размеры бластомеров  и связь между ними. Биологически полноценными считаются эмбрионы, имеющие  правильную шарообразную форму, гомогенную светлую цитоплазму, прозрачную неповрежденную оболочку, одинакового размера бластомеры с плотным межклеточным контактом. Пригодные к пересадке эмбрионы на 7-8-й день после осеменения соответствуют  стадиям развития: ранняя и поздняя  морула, ранняя и поздняя бластоциста. Для ранней морулы характерно наличие 16-32 бластомеров. Бластомеры разной величины, набухшие, перивителлиновое пространство свободно от отдельных бластомеров. У поздней морулы число бластомеров  увеличивается до 32-64. Краевые бластомеры равной величины, завершено уплотнение между бластомерами, отсутствуют разрывы связей между ними. 

Для ранней бластоцисты характерно наличие 64-130 бластомеров. На этой стадии образуются трофобласт и бластополость. Перивителлиновое пространство еще  различается. Поздняя бластоциста  имеет более 130 бластомеров с четко  выраженной бластополостью. Эмбриобласт  локализирован и отчетливо виден. Трофобласт непрерывный. Зона пеллюцида  утончена. Перивителлиновое пространство отсутствует. 

Эмбрионы с асинхронным  дроблением, с бластомерами разной величины, с повреждением прозрачной оболочки, с лизисом бластомеров  и нарушением связи между ними, а также с агглютинацией (разрушением) цитоплазмы, множественными включениями  в перивителлиновом пространстве не пригодны для трансплантации. Для  неоплодотворенной яйцеклетки характерна однородность клеточной массы, округлая форма, отсутствие бластомеров.  Для  морфологической оценки качества морул  и бластоцист рекомендуется 5-ти бальная  шкала:

отличные - эмбрионы сферической  формы, стадия развития соответствует  возрасту, зародышевые клетки однородные по размеру и цвету;

хорошие - эмбрионы соответствуют  стадии развития, но имеются небольшие  отклонения: неправильная форма, наличие  незначительных включений в перивителлиновом пространства, выделение одного или  нескольких бластомеров, увеличение перивителлинового  пространства;

удовлетворительные - эмбрионы имеют клетки со структурными отклонениями, деформированные бластомеры, в перивителлиновом пространстве мертвые клетки;

условно-годные - эмбрионы с  деформированной прозрачной оболочкой, частичным разрушением бластомеров, нарушением связи между ними, фрагментацией  цитоплазмы, сжатием бластомеров;

неудовлетворительные –  эмбрионы, отстающие в развитии, со структурными нарушениями, имеющие  клетки разного размера, дефекты  прозрачной оболочки (сколы, трещины), содержат включения в перивителлиновом пространстве. 

Манипуляции с эмбрионами с момента их получения до пересадки  или криоконсервирования занимают от одного до семи часов. В течение  этого времени необходимо создать  условия, обеспечивающие сохранение жизнеспособности эмбрионов. Кроме того, продолжение  развития зародышей при кратковременном  культивировании является дополнительным тестом в их морфологической оценке. 

Культивирование эмбрионов  проводят в часовых стеклах в 0,5-1,0 мл культуральной среды, помещенных в чашки Петри, в термостате при +37°С во влажной атмосфере и при  постоянном составе газовой среды (90% азота, 5% кислорода и 5% углекислого  газа). После чего их оценивают на пригодность к пересадке. Эмбрионы, пригодные к эмбриопересадке, помещают в специальные пайетты с помощью  микроаспиратора по схеме: среда  для культивирования (2,5-3,0 см) - воздушный  пузырек - (0,5-0,7 см) - эмбрион со средой (2,0-3,0 см) - воздушный пузырек (0,5-0,7 см) - среда для культивирования (2,5-3,0 см). Пайетта готова для пересадки. Для транспортировки на большие  расстояния свежеполученные эмбрионы заправляют в пайетты, помещают в  специальный контейнер (конструкции  БелНИИЖ). В таком состоянии зародыши сохраняют жизнеспособность до 24 часов.  Кроме морфологической, дается оценка эмбрионов по адсорбционным свойствам оболочек и цитоплазмы бластомеров к различным красителям. Для улучшения морфологической оценки используют флюоресцентную окраску, позволяющую отличить живые эмбрионы от погибших. В частности, этот метод наиболее пригоден для оценки жизнеспособности эмбрионов крупного рогатого скота после их культивирования и замораживания. С помощью флюоресцентных красящих веществ FDA и DAP1 через 3-10-минутный период возможно быстрое и достаточно надежное определение способности эмбрионов к развитию в ранних стадиях. Живые эмбрионы и даже живые бластомеры ярко флюоресцируют после инкубации в FDA, но не флюоресцируют после инкубации в DAP1. У погибших эмбрионов или бластомеров реакции обратные. Эти методы позволяют более точно определять жизнеспособность эмбрионов под микроскопом.

Ряд авторов предлагает использовать синьку Эванса. В живых эмбрионах  при температуре 37 градусов ею окрашивается только зона пеллюцида, которую затем  обесцвечивают в растворе Рингера. В мертвых же эмбрионах краска прочно фиксируется на бластомера.

Однако следует учитывать, что флюоресцентная окраска лишь дополняет и улучшает основной метод  оценки эмбрионов - морфологический. Наиболее важными морфологическими признаками при оценке жизнеспособности эмбрионов  служат объем, окраска, расположение клеток, величина перивиталлинового пространства и вид неповрежденной зоны пеллюцида. Идеальный эмбрион должен быть компактным, сферической формы, с однородной окраской, с клетками одинаковой величины, с гладкой, плоской и равномерно сформированной зоной пеллюцида, без  включений в перивителлиновом пространстве.

 

4.3 Криоконсервирование эмбрионов.

Использование технологии криоконсервирования  зародышей позволяет сохранить  ценный эмбриоматериал при отсутствии животных-реципиентов, а также проводить  трансплантацию эмбрионов в строго определенные сроки с максимальной эффективностью.

Технология глубокого  замораживания и оттаивания зародышей  предусматривает следующие этапы: выбор криопротектора и приготовление  криозащитных растворов; качественная оценка зародышей, насыщение их криопротектором; постепенное охлаждение эмбрионов  с помощью программных замораживателей; перенос эмбрионов в жидкий азот и их хранение; оттаивание при определенной температуре; выведение криопротектора из эмбриона; морфологическая оценка зародышей на пригодность к трансплантации.

Для криоконсервирования  используют свежеполученные эмбрионы только отличного и хорошего качества. Основным условием при этом является сокращение до минимума времени манипуляций  с эмбрионами от момента извлечения до замораживания.

Операции по подготовке зародышей  к криоконсервированию (оценка их жизнеспособности, насыщение эмбрионов криопротектором, заправка в пайетты) проводят в стерильном боксе. Посудой для проводки эмбрионов  служат стерильные часовые стекла с  лунками и чашки Петри. Наиболее эффективно замораживание поздних  морул и ранних бластоцист. В качестве криопротекторов используют 1,4 М (10%) раствор глицерина и 1,5 М этиленгликоль.

Основой для приготовления  рабочих растворов криопротекторов  является среда Дюльбекко, содержащая 100 ед/мл ампициллина и 12,0 мкг/мл гентамицина  и 20% фетальной сыворотки теленка. Насыщение эмбрионов глицерином осуществляется поэтапно в возрастающих концентрациях растворов (0,35 М; 0,7 М; 1,05 М; 1,4 М). Проводка осуществляется в  стеклах с лунками с экспозицией  по 5 минут в первых трех концентрациях  глицерина и 10 минут в 1,4 М раствора.

Насыщение эмбрионов 1,5 М  раствором этиленгликоля проводится одноступенчато с выдержкой 10 минут. После выдержки в последнем растворе криопротектора эмбрионы с помощью  микроаспиратора помещают в пайетты (не более 2 зародышей). Нижний конец  пайетты закрывают пластиковой  пробкой, на которой указывают дату извлечения, номер донора и номер  пайетты.

Для замораживания эмбрионов  используют программные замораживатели: ЗЭМ-4 (Украина), Миникул АС-25 (Франция), ЗМБИ-К (Россия).

Пайетты с эмбриоматериалом переносят в камеру для замораживания  и включают программу. Снижение температуры  происходит автоматически до заданного программного уровня. Затем пайетты переносят в жидкий азот для хранения.

Хранение замороженных эмбрионов  осуществляется непосредственно в  жидком азоте, в сосуде Дьюара. Используются стандартные канистры для хранения гранул спермы. Для транспортировки  эмбрионов в замороженном состоянии  применяют сосуд Дьюара емкостью 5 л с аналогичными канистрами.

Оттаивание пайетт с замороженными  эмбрионами можно проводить одним  из двух способов. Первый – в водяной  бане при +37єС в течение 10 секунд; второй – оттаивание вначале на воздухе  при +20-22єС в течение 10 секунд, затем  в водяной бане при +25єС также 10 секунд. Затем пайетту освобождают от маркерной пробки, конец с пыжом  отрезают и содержимое помещают на часовое стекло. Под микроскопом  проводят подсчет количества оттаянных  эмбрионов и предварительную  морфологическую оценку. После этого  эмбрионы отмывают от криопротектора.

Удаление криопротектора глицерина осуществляется в обратной последовательности (1,05 М; 0,7М; 0,35М) с  выдержкой по 5 минут в каждом из растворов. Эмбрионы после проводки помещают в 20% эмбриональную сыворотку  и ставят в термостат при +37єС на кратковременное культивирование (до 1 часа). Зародыши, замороженные в 1,5М  растворе этиленгликоля, после оттаивания также помещают в 20% эмбриональную  сыворотку и культивируют. Затем  проводят заключительную морфологическую  оценку под микроскопом. Жизнеспособные зародыши заправляют в пайетты и  пересаживают реципиентам.

Проведенные нами исследования по использованию 1,4М раствора глицерина  и 1,5М этиленгликоля показали высокие  результаты сохранности и приживляемости замороженно-оттаянных зародышей (табл. 5).

Однако, одноступенчатый  способ насыщения зародышей 1,5М раствором  этиленгликоля позволяет сократить  в 2–2,5 раза затраты рабочего времени  при манипуляциях с эмбрионами по сравнению с четырехступенчатым насыщением зародышей 1,4М раствором  глицерина.

Таблица 5 - Приживляемость замороженно-оттаянных эмбрионов в зависимости от используемого криопротектора и способа насыщения

Показатели	Криопротекторы
	1,4М р-р глицерина	1,5М р-р этиленгиколя
Заморожено эмбрионов	64	55
Оттаяно эмбрионов	53	49
Жизнеспособных эмбрионов	46	44
Сохранность в %	86,8	89,7
Пересажено эмбрионов	41	43
Стерильных реципиентов	20	21
Затрачено времени при манипуляции  с эмбрионами, мин.	25	10

Выявлена зависимость  сохранности и приживляемости замороженно-оттаянных  эмбрионов от способа оттаивания (табл. 6).

Таблица 6  -   Эффективность  способов оттаивания эмбрионов крупного рогатого скота 

Показатели	Способы оттаивания эмбрионов
	Водяная баня+37оС	На воздухе +20-22оС, затем в водяной  бане +25оС
Заморожено эмбрионов	58	68
Оттаяно эмбрионов	48	50
Жизнеспособных эмбрионов	40	46
Сохранность в %	83,3	92,0
Пересажено эмбрионов	40	45
Стерильных реципиентов	17	24

Из анализа данных  видно, что лучшие результаты по сохранности (92,0%) и приживляемости (53,3%) деконсервированных эмбрионов были получены при оттаивании зародышей на воздухе при +20-22оС, а затем в водяной бане при +25оС. 

В последнее время эффективным  является использование 0,7М сахарозы для выведения криопротекторов  из клеток зародышей. Это повышает их сохранность и приживляемость. 

 

4.4 Пересадка зародышей реципиентам.

           В качестве реципиента отбирают  гинекологически здоровых коров  после двух-трех  нормальных половых  циклов. Для отбора реципиентов  основным показателем является  отсутствие гинекологических отклонений, а продуктивные, племенные и породные  качества большой роли не играют. Вместе с тем, у реципиентов  с плохой упитанностью, низкой  оплодотворяемостью после первого  осеменения, могут плохо приживаться  эмбрионы. В среднем на каждого  донора отбирают 5-6 реципиентов.  Большинство специалистов считает,  что в качестве реципиентов  наиболее пригодны полновозрастные  телки с хорошими племенными  кондициями.