Общая характеристика биореакторов

1.Общая характеристика биореакторов

Основным аппаратурным элементом  биотехнологического процесса является биореактор - ферментер. Биореакторы предназначены для культивирования микроорганизмов, накопления биомассы, синтеза целевого продукта .Это сооружение, основной целью которого является создание оптимальных условий для развития определенных микроорганизмов. Такие камеры используют во многих видах деятельности, от производства кисломолочной продукции до фармакологии и медицинских исследований. Биореакторы изготавливают из высоколигированных марок стали, иногда из титана. Внутренняя поверхность биореактора должна быть отполирована.

2. Типы биореакторов

Биореакторы подразделяют на три основные группы

1)   реакторы с механическим  перемешиванием;

2)   барботажные колонны, через которые для перемешивания содержимого пропускают воздух;

3)   эрлифтныереакторы  с внутренней или внешней циркуляцией;

Биореакторы первого типа используют чаще всего, так как они позволяют легко изменять технологические условия и эффективно доставлять к растущим клеткам воздух, определяющий характер развития микроорганизмов и их биосинтетическую активность. В таких реакторах воздух подают в культуральную среду под давлением через разбрызгиватель - кольцо с множеством маленьких отверстий. При этом образуются мелкие пузырьки воздуха и за счет механического перемешивания обеспечивается их равномерное распределение. Для этой же цели используют мешалки — одну или несколько.

Мешалки, разбивая крупные  пузырьки воздуха, разносят их по всему  реактору и увеличивают время  пребывания в культуральной среде. Эффективность распределения воздуха зависит от типа мешалки, числа оборотов, физико-химических свойств среды.

Конструктивные особенности  барботажных колонн и эрлифтных биореакторов дают этим типам ферментеров некоторые преимущества перед реакторами с механическим перемешиванием. Барботажные колонны более экономичны, так как перемешивание в них происходит восходящими потоками воздуха равномерно по всему объему. Отсутствие механической мешалки исключает один из путей проникновения в биореактор посторонних микроорганизмов. В барботажных биореакторах не возникает сильных гидродинамических возмущений (сдвигов слоев жидкости культуральной среды относительно друг друга).

В барботажных колоннах воздух подают под высоким давлением в нижнюю часть биореактора; по мере подъема мелкие пузырьки воздуха объединяются, что влечет неравномерное его распределение. Кроме того, подача воздуха под высоким давлением приводит к сильному пенообразованию.

В эрлифтных биореакторах воздух подают в нижнюю часть вертикального канала. Поднимаясь, воздух увлекает за собой жидкость к верхней части канала, где расположен газожидкостный сепаратор (здесь частично выходит воздух). Более плотная деаэрированная жидкость опускается по другому вертикальному каналу ко дну реактора и процесс повторяется. Таким образом, в эрлифтном биореакторе культуральная среда вместе с клетками непрерывно циркулирует в биореакторе.

3. Подготовка биореактора к работе

 Итак, для культивации микроорганизмов необходимо:

1. подготовить биореактор для культивации;

2. простерилизовать его;

3. подготовить посевной материал - инокулант.

 В ходе подготовки  реактора ёмкость биореактора и необходимые подводы промываются, внутрь помещаются датчики, подключаются необходимые для процесса дополнительные устройства - насосы, титровальные установки и т.д. Биореактор и подводы необходимо стерилизовать, чтобы устранить возможные источники инфекции. В лабораторных биореакторах, в зависимости от ёмкости и конструкции, используется один из следующих способов стерилизации:

1. Автоклавирование - помещение биореактора и подводов в автоклав.

2. Стерилизация на месте - подача пара в рубашку биореактора. При этом реактор не перемещается, и пар подаётся в рубашку через трёхходовой клапан.

 3.Стерилизация изнутри - в этом случае при помощи внутренних термоэлементов доводят реактор до температуры стерилизации. При этом стеклянные части реактора должны быть защищены металлическим покрытием.

 Первый способ применяется  для стеклянных или стеклометаллических реакторов ёмкостью до 10 литров, потому что более крупный реактор трудно поместить в автоклав.

 Второй способ применяется  для стеклянных и стеклометаллических реакторов со стальной рубашкой.

 Третий вариант обычно  используется в реакторах типа  bench-top с мощными встроенными нагревателями, термостатом или парогенератором, ёмкостью до 20 литров.

 Во время стерилизации  ёмкость биореактора и подводы должны быть герметически закрыты, чтобы внутрь не проникли обитающие во внешней среде микроорганизмы:

 Питательную среду  можно стерилизовать отдельно  и затем стерильно ввести в  реактор, например, при помощи  перистальтического насоса. Можно  стерилизовать питательную среду  и вместе с биореактором.

3.1принцип работы биореактора

До помещения в ферментер исходный рабочий продукт – необходимую биологическую культуру – хранят в специальных условиях, так сказать, в неактивном состоянии – например, замораживают. Для культивации небольшую пробу микроорганизмов наращивают в лабораторных условиях до состояния «рабочей порции»- достаточного для динамичной культивации количества. После данного асептического этапа культуру помещают в биореактор, предварительно его поверхность, воздух в камере и все соединительные отверстия стерилизуют, используя для этого водяной пар и вентиляцию. После очистки начинается этап инокуляции – когда помещенные внутрь ферментера культуры начинают активно размножаться и расти, благодаря тому что для них создают оптимальные условия и питательную среду. Конечным продуктом подобных процессов является необходимое количество биомассы или полезные метаболиты микроорганизмов

4. Устройство лабораторного биореактора

Конструкивно, лабораторный биореактор может быть выполнен по-разному:

1. стеклянный (без рубашки) с верхней крышкой из нержавеющей стали.

 2.стеклянный (с рубашкой) с верхней крышкой из нержавеющей стали.

3. стеклянный (без рубашки) с верхней и нижней крышками из нержавеющей стали.

4.из дух частей - стекло и нержавеющая сталь.

 Обычно в часть из  нержавеющей стали входят рубашка  и порты для размещения электродов.

5. из нержавеющей стали со смотровыми окошками.

4.1Типичные составляющие ёмкости биореактора следующие

Крышка (верхняя)

 В верхней крышке биореактора расположены:

1. порты для электродов (pH, pO2, T, p);

2. порты для ввода титровальной и подкормочной среды;

3. трубочки для взятия проб;

 4.порт для подключения конденсатора и фильтра исходящего воздуха;

5. уплотнитель привода (если изменён верхний привод мешалки);

6. крепление барботёра (если нет нижней крышки).

Крышка (нижняя)

 Если у биореактора есть нижняя крышка, то в ней могут иметься следующие порты и элементы:

1. выпускной клапан;

2. устройство для отбора  проб;

3. барботёр;

4. привод нижней мешалки;

5. нагреватели.

Мешалка

 Мешалка механически  насажена на ось. Её диаметр  обычно составляет до половины  внутреннего диаметра реактора. Расположение оси мешалки зависит  от того, вершний или нижний привод у реактора. Верхний привод реализуется конструктивно проще, так как упрощается уплотнение. Техническое обслуживание при этом также проще: отсоединяется мотор, затем снимается крышка вместе с осью и мешалкой.

 В свою очередь, нижний  привод даёт ряд преимуществ,  связанных с режимами эксплуатации. В этом случае, можно обеспечить  перемешивание в биореакторе со снятой верхней крышкой. Это важно для моделирования смешивания, а также для очистки и промывки. При этом также проще обеспечить однородность смеси, так как мешалка находится близко ко дну.

 Стандартная турбина Руштона - самая популярная

 Наиболее распространённая  конструкция мешалки - стандартная  турбина Руштона. Её диаметр обычно составляет около половины внутреннего диаметра реактора. Турбина Руштона - это типичная мешалка, создающая радиальные потоки. Обычно на оси находятся 2-3 мешалки.

 Перемешивание механически чувствительных микроорганизмов

 Для культивации чувствительных  к механическим повреждениям  грибков рекомендуются перемешивающие  системы, создающие, в основном, аксиальные потоки, обеспечивая  более равномерное перемешивание.  Одни из наиболее распространённых  систем - Ekato Intermig. Известна также как называемая "система противоточного перемешивания". По отношению к более чувствительным клеткам (ткани, клетки животных), подход к перемешиванию должн быть иным, потому что в этом случае поток должен быть ламинарным.

Отражающие перегородки

 Это вертикальные, расположенные  радиально пластины. Их ширина  составляет примерно 10% от внутреннего  диаметра биореактора. Обычно в биореакторе 3-4 такие перегородки. Они необходимы для предотвращения образования воронок. Образование воронок может значительно снижать иаксимально возможную скорость вращения мешалки. Отражающие перегородки повышают на 20% потребление элетроэнергии при той же скорости вращения.

Барботёр

 Через барботёр в среду ферментации подводится сжатый воздух. Наиболее распространённое конструктивное решение - кольцевая труба с маленькими (d = 0.05 - 0.15 мм) отверстиями в нижней части. Для взращивания грибковых культур можно применять трубообрзный барботёр с конусообразным каналом выхода воздуха. Такая конструкция устраняет возможное образование трещин, потому что диаметр выходного отверстия больше, и давление больше, так как оно не распределяется между многими отверстиями.

Ёмкость биореактора

 В зависимости от  конструкции биореактора, ёмкость изготавливается из стекла, металла или их комбинации. Отношение высоты реакора к диаметру лежит в пределах 1.5-2.5. Производимые в Европе реакторы обычно более вытянуты, чем сделанные в США. Заполнение реактора около 70%. Такова доля рабочего объёма в ёмкости биореактора.

 Требования к материалам  ёмкости высоки, чтобы не произошло  замедления роста микроорганизмов.  Это же относится к любым  другим частям (датчики, трубы  и др.), помещаемым внутрь биореактора. Стекло должно быть на 100% боросиликатным. Все металлические части должны быть из нержавеющей стали.

Конденсатор, выходной клапан и фильтр

 Задача конденсатора - охлаждение выходящего воздуха,  в результате чего пена и  другие жидкие частицы отделяются. С этой целью внутри конденсатора  находится змеевик или другое  устройство, обеспечивающее максимально  длинный путь воздуха. Снаружи  находятся двапатрубка для подвода холодной воды. Обычно конденсатор подключают к порту, находящемуся в центре крышки. Выход конденсатора соединён с выпускным клапаном. При помощи выпускного клапана можно регулировать необходимое избыточное давление в реакторе. Выход клапана соединён с пористым микробиологическим фильтром.

5.главные требования эксплотации биореактора

1.стерильность;

2.перемешивание/аэрация как существенный фактор обмена масс;

3.контроль и управление процессом.

Cтерильность

Одним из основных сравнительных  показателей качества биореакторов является их способность обеспечивать стерильность ферментации. Это свойство в большой мере определяется конструкцией биореактора и качеством обработки поверхности. Большинство факторов риска нестерильности связаны именно с герметичностью на разных стадиях процесса и качеством обработки поверхности. Наиболее вероятными факторами риска нестерильности, с точки зрения конструкции, являются следующие:

1.Cальники мешалки, уплотнения портов для размещения датчиков и других устройств

 Один из наиболее  типичных путей проникновения  инфекции - сальники мешалки. Не  всегда легко одновременно обеспечить  хорошее уплотнение и беспрепятственное  вращение привода мешалки. Необходимо  поддерживать чистоту сальников,  чтобы в них не скапливалась  инфекция. Чтобы устранить связанные  с сальниками проблемы, привод  мешалки делают на принципе  магнитного привода. В этом  случае вращательный момент передаётся  при помощи магнитного поля, и  реактор может быть совершенно  закрытым. Что касается уплотнения  датчиков и прочих устройств,  нужно иметь ввиду, что они должны закрываться силой рук оператора, а также их свойства не должны изменяться под воздействием температуры стерилизации.

2. "Kарманы", неровности и другие слабые места, позволяющие инфекции скапливаться внутри реактора.

 Внутри биореактора инфекция может скапливаться в различных неровностях. В этих местах могут затаиться посторонние микроорганизмы. Поэтому дно реактора должно быть закруглённым, без острых углов, а поверхность - отполирована.

3. Hепродуманная методика и конструкция для взятия образцов.

 При взятии образцов  нужно предусмотреть возможность  подачи пара или огня, чтобы  после окончания взятия образца  инфекция не успела попасть  в ферментационную жидкость.

4. Фильтрация входящего  и выходящего воздуха. 

 Воздух должен входить  в биореактор через воздушный фильтр соответствующей пористости, чтобы задержать инфекцию. Входящий воздух желательно пропустить перед фильтрацией через подогреваемые трубочки. Таким образом стараются термическим воздействием по крайней мере частично уничожить инфекцию Проникновение инфекции через линию выходящего воздуха предотвращается фильтром выходящего воздуха.

5. Поддержание избыточного  давления.

 Важно поддерживать  избыточное давление (0.2-0.5 bar) в полости реактора между ферментационной жидкостью и крышкой реактора, чтобы создать сопротивление проникновению инфекции.

6. Постоянная и эффективная  теплопередача. 

 Это необходимо для  того, чтобы температура стерилизации  достигалась с одинаковым потреблением  энергии, а прогрев был равномерным.  Если прогрев полости биореактора не будет равномерным, то внутри могут появиться зоны, в которых температура стерилизации не достигнута.

Перемешивание/аэрация как существенный фактор обмена масс

Перемешивание и аэрация  — не единственные факторы, определяющие, каким будет обмен массы в  биореакторе, т.е. как будут расти микроорганизмы. Это определяется как особенностями данного вида микроорганизмов, так и сдалансированный выбор питательной среды, режимы процесса и т.д