Аппаратурная схема получения жидкого бактериофага (графическая схема)

ГОУ ВПО Нижегородская  государственная медицинская академияМЗСР

Аппаратурная  схема получения жидкого  бактериофага (графическая  схема)

Загиров Т.Р., 572 группа

 

 

Нижний Новгород, 2012

1.Характеристика бактериофагов

Для лечения и  профилактики ряда инфекций наряду с  другими препаратами применяют вирусы бактерий — бактериофаги, обладающие высокой специфичностью к патогенным и условно- патогенным бактериям. Избирательность их действия значительно выше, чем антибиотиков и других химиотерапевтических средств. Бактериофаги не оказывают влияния на нормальную микрофлору. Они сами фактически относятся к нормальной микрофлоре. Естественной средой обитания многих фагов служат фекалии, речные и сточные воды, куда они попадают вместе с фекалиями и где играют роль одного из факторов самоочищения внешней среды.

Феномен бактериофагии  впервые наблюдал в 1898 г. Н. Ф. Гамалея. Однако выделен такой литический агент был лишь в 1917 г. д'Эреллем. Это был бактериофаг, специфичный для палочки дизентерии Григорьева—Шига. В 30—40-х годах бактериофаги заняли заслуженное место среди других лечебно-профилактических препаратов. Большую группу среди них составляют бактериофаги против кишечных инфекций: дизентерийный, брюшнотифозный, сальмонеллезный групп АВСДЕ, коли-протейный. Широкое распространение антибиотикорезистентиых форм бактерий и осложнения, связанные с применением химиотерапевтических средств, привели к потребности в так называемых раневых бактериофагах — стафилококковом, протейном, синегной- ной палочки.

Возможность приготовления  бактериофагов, высокоспецифичных по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам (в том числе к антибиотико- и сульфаниламидо- устойчивым ф'ормам), представляет большой интерес для лечения и предупреждения заболеваний, отягощенных дисбактериозом — нарушениями в нормальной' аутофлоре.

Получение препаратов бактериофагов высокого качества достигается только благодаря хорошо организованной совместной работой производственников, сотрудников лабораторий и больниц. Широкая валентность и сила литического действия бактериофагов определяется систематическим подбором штаммов от больных и бактерионосителей, постоянным обновлением производственных штаммов за счет свежевыделенных. Одновременно производится непрерывная работа по выделению изначально сильных штаммов вирулентных фагов из сточных и речных вод (реже из фекалий или гноя). Для повышения активности фагов используются пассажи in vitro, а также на животных. Одним из эффективных методов пассирования in vivo является использование изолированной петли тонкого кишечника морских свинок или белых мышей.

Из большой  коллекции монофагов комплектуют  комплексный маточный бактериофаг, поступающий для получения серии  в производственный реактор. В качестве субстрата для размножения серийного препарата используют набор штаммов. Лечебная и профилактическая эффективность бактериофага определяется тем, в какой мере его структура соответствует этиологической структуре заболеваний на определенной территории. Вот почему при применении бактериофагов очень важно не только проверять чувствительность возбудителя к препарату, но и направлять все нелизирующиеся штаммы бактерий в институт, из которого получен бактериофаг. Нецелесообразно использовать для лечения (или профилактики) бактериофаг, к которому не чувствителен штамм бактерий, выделенный от больного (или большая часть штаммов бактерий, циркулирующих в данной местности). Возможен подбор и специальное приготовление для конкретных больных аутофагов к штаммам, которые не лизируются серийным препаратом.

Бактериофаг дизентерийный  — препарат, активный в отношении дизентерийных бактерий Флекснера, Зонне и Ньюкасл, Штуцера — Шмитца и Григорьева — Шига. Применяют для лечения и профилактики дизентерии.

Бактериофаг брюшнотифозный — смесь бактериофагов, активных в отношении возбудителей брюшного тифа различных фаготипов. Препарат применяют для предупреждения заболеваний брюшным тифом контактировавших с больным.

Бактериофаг сальмонеллезный групп АВСДЕ — смесь фаго- лизатов разных сальмонелл. Сальмонеллезный бактериофаг

применяют для  лечения и санации больных  и носителей, а также с профилактической целью по эпидпоказаниям на предприятиях мясоперерабатывающей промышленности. Препарат мгожет быть использован и в ветеринарной практике.

Коли-бактериофаг — смесь бактериофагов, активных в отношении наиболее распространенных серологических групп.кишечной палочки. Применяется для лечения и профилактики коли- энтеритов.

Бактериофаг протейный  представляет большой интерес в  связи с проблемой дисбактериоза, так как активен по отношению к бактериям рода Proteus (P. vulgaris и P. mirabilis), одному из высокоустойчивых к антибиотикам микроорганизмов, агрессивность которого выявляется при нарушениях нормального состава микроорганизмов. Может выпускаться в ассоциации с коли-фагом под названием коли-протейный бактериофаг.

Бактериофаг стафилококковый  — фильтрат фаголизата стафилококков. Его применяют местно для лечения гнойных заболеваний — фурункулеза, гнойно-осложненных ран, абсцессов и др. При кишечных заболеваниях, связанных со стафилококком, бактериофаг вводится через рот или п клизмах подобно кишечным фагам.

Бактериофаг пиоцианеус (синегнойный) — фильтрат фаголизата Pseudomonas aeruginosa, специфически лизирующий соответствующую бактерию. Применение подобно стафилококковому.

 

 

 

 

 

2.Технологический процесс производства бактериофагов.

Технологический процесс производства жидких бактериофагов состоит из следующих этапов: подбор штаммов для производства данного вида фага, получение маточных бактериофагов, приготовление серий жидкого бактериофага, контроль готового препарата на стерильность, безвредность и литическую активность, этикетировка и упаковка препарата (рис. 2).

Подготовка  и  наработка микроорганизма - продуцента.

В связи с тем, что исходная культура продуцента  не  отличается высокой стабильностью при хранении, предприятие использует чистую  культуру  в  количестве  3  пробирок, из которых одну  пробирку  с   исходным   продуцентом   используют   на размножение исходного  штамма,  вторую  используют  для  организации  микробиологического контроля за исходным штаммом-продуцентом, третью оставляют в резерве.

     Подготовку  биообъектов проводят согласно  прилагаемым  к регламентам  инструкциям. В этих целях исходный  штамм оживляют после добавления  стерильной жидкой питательной  среды  с  последующим высевом  на уплотненную питательную среду  (агар). Убедившись в подлинности и чистоте культуры (культура называется чистой, если родительские и дочерние клетки в ней практически неразличимы и между ними нельзя установить родственные связи), операции по пересеву штамма на богатую питательными веществами среду  возрастающих объемов (или площади) повторяют несколько раз в асептических условиях, переходя от пробирок к колбам различного объема, помещаемым на качалочные устройства (шюттель-аппараты).

    Окончательную  наработку биообъекта осуществляют  в цехе, используя небольшие ферментаторы-инокуляторы (1-2 стадии), в которых наращивают посевной материал для промышленных ферментаций в количестве 5-20% от объема питательной среды в основном аппарате. При этом одноклеточные культуры чаще доводят до середины-окончания Log-фазы, что позволяет сильно сократить время адаптации клеток (Lag-фазу) при переносе их на питательную среду в производственный ферментер.

По своей конструкции  и технологической оснастке инокулятор для аэробных микроорганизмов аналогичен основному ферментеру и снабжен системами аэрирования, перемешивания, термостатирования. В инокуляторах, как и в промышленных ферментерах целесообразно поддерживать  незначительное избыточное давление воздуха, когда случайные утечки  будут происходить только в направлении из системы, а не наоборот, что значительно облегчает поддержание асептических условий.

4. Подготовка  и наработка бактериофага

Также как и при наработке  микроорганизмов, на производство поступают 3 пробирки с чистой культурой бактериофага, из которых одну  пробирку  с   исходным   продуцентом   используют   на размножение исходного штамма,  вторую  используют  для  организации  контроля, третью оставляют в резерве. Подготовку проводят согласно прилагаемым  к регламентам инструкциям. В этих целях исходный штамм оживляют после добавления стерильной жидкой питательной среды  со специфичной культурой бактерий (МПБ). Для обнаружения бактериофага используют титрование по методу Грациа: 1,0 мл фага смешивают в пробирке с 0,5 мл бактериальной культуры и добавляют в эту же пробирку расплавленный МПА. Все содержимое выливают в чашку с МПА. Дают застыть верхнему тонкому слою и ставят в термостат. При встрече фага с бактерией, происходит лизис последней и образуется негативная колония фага. Такие негативные колонии затем подсчитывают для определения титра. Титром фага называют количество фаговых частиц в 1 мл препарата фага.⁴

Наработка бактериофагов  происходит путем добавления в ферментер с бульонной культурой бактерий, который выдерживают при 37°С. Ферментер предварительно стерилизуют острым паром, герметизуют все полости и узлы, а затем заполняют бульонной культурой. Он снабжен системами аэрирования, перемешивания, термостатирования и светодатчиками, контролирующими окончание процесса наработки бактериофага. Сущность контроля окончания наработки заключается в том, что чем прозрачнее становиться среда, тем больше бактерий лизировано и наработано бактериофагов. На процесс наработки уходят примерно сутки. Затем раствор фильтруют, проверяют на чистоту, стерильность, безвредность и активность (силу действия).

5. Очистка, Стерилизация  и Контроль

Фаги более устойчивы  во внешней среде, чем бактерии. Выдерживают  давление до 6000 атм., устойчивы к  действию радиации, до 13 лет не теряют своих литических свойств, находясь в запаянных ампулах. 
Некоторые вещества, например, хлороформ и ферментативные яды (цианид, флорид), не оказывают влияния на фаги, но вызывают гибель бактерий. 
Однако фаги быстро погибают при кипячении, действии кислот, УФ-лучей. Поэтому наиболее приемлемым способом стерилизации для фагов является фильтрация, которая проводится при помощи мембранных фильтров с размером пор 0,22 мкм. Мембранные фильтры представляют собой тонкие (100-150мкм) пластины из полимерных материалов, характеризующиеся ситовым механизмом задержания микроорганизмов и постоянным размером пор. Такая стерилизация позволяет освобождать жидкости (биопрепараты, сыворотку крови, лекарства) от бактерий, грибов, простейших и вирусов, в зависимости от размеров пор фильтра. Для ускорения фильтрации создают повышенное давление в емкости с фильтруемой жидкостью или пониженное давление в емкости с фильтратом. Во избежание быстрого засорения фильтра мембраны используют в сочетании с префильтрами. В качестве префильтрации можно использовать фильтрацию через глубинные фильтры с размером пор до 0,1 мкм, которые не дают гарантии качества в отличие от мембранных фильтров, но позволяют избавиться от крупных частиц питательной среды и конгломератов бактерий. Глубинные фильтры характеризуются сложным механизмом задержания микроорганизмов (ситовым, адсорбционным, инерционным). Глубинные фильтры классифицируют на: керамические и фарфоровые (размер пор 3-4мкм), стеклянные (около 2мкм), бумажно-асбестовые (1-1,8мкм).

Керамические (Патронные) фильтры  применяются в микробиологической промышленности для освобождения концентрата  от взвешенных частиц и микроорганизмов. Элемент подобного фильтра изготавливают  из пористой керамики или прессованного кизельгура в виде патронов диаметром 50мм, высотой 270мм и толщиной стенки 45мм. пористость патрона — 340 %. Элементы закрепляют в отверстиях решетки, установленной в корпусе. Очищаемый раствор под давлением 2+2,5 бар подается в нижнюю часть корпуса, поступает через капилляры во внутреннюю часть элемента, а затем выливается из него в верхнюю часть фильтра и эвакуируется через патрубок за пределы установки. Недостатками керамических и фарфоровых фильтров является продолжительность стерилизации, потеря раствора в порах толстого фильтра, образование микротрещин из-за хрупкости материала и, следовательно, ненадежность стерилизации.

Стеклянные микропористые  фильтры изготавливают из сваренных  зерен стекла с диаметром до 2 мкм. Фильтры имеют вид пластинок  или дисков, закрепленных в стеклянных сосудах. Стеклянные фильтры по сравнению  с другими мелкопористыми фильтрами  более удобны для применения в  аптечной практике.

Бумажно-асбестовые фильтры  несовершенны. Стеклянные фильтры малопроизводительны, бумажно-асбестовые фильтры состоят  из волокнистых материалов, и имеется  угроза отрыва волокон от фильтра. Попадая  в организм с раствором, такие  волокна могут вызвать различные  патологические реакции.⁵

В связи с тем, что у  метода фильтрации есть дополнительный риск загрязнения микроорганизмами по сравнению с другими способами  стерилизации, непосредственно перед  наполнением можно рекомендовать  повторную фильтрацию продукта через  дополнительный удерживающий микроорганизмы стерилизующий фильтр. Окончательную  стерилизующую фильтрацию продукта следует проводить как можно  ближе к месту наполнения.

Перед использованием стерилизующего фильтра и сразу после его  использования следует проверить  отсутствие у него повреждений таким  методом, как тест на "точку пузырька", методом диффузионного потока или  выдержкой под давлением.⁶

Для очистки полученного  фильтрата от токсинов необходимо использовать ультрафильтрацию. Осуществляемое   концентрирование   сопровождается    очисткой    от балластных  низкомолекулярных  примесей.   Однако   энергозатраты   оказываются рентабельными при концентрировании  раствора  до  содержания  сухих веществ не более 30%, что связано с забиванием пор мембраны белковыми молекулами и как следствие резким снижением скорости процесса. Процесс ультрафильтрации в режиме  диализа  позволяет  получать высокоочищенные  препараты.  Для  его  осуществления  в   получаемый концентрат  постоянно  добавляют  чистую  воду.  Такая   пятикратная промывка позволяет в 250-300  раз  повысить  активность  бактериофагального раствора, т.е. при концентрации  30%  раствор содержит  практически один препарат бактериофага. На практике процесс ультрафильтрации проводят в циркуляционных аппаратах периодического действия. Перед подачей раствора на  стадию ультрафильтрации из него предварительно удаляют клетки продуцента  и для предотвращения развития посторонней  микрофлоры  на  поверхности мембран  подвергают  стерилизующей  фильтрации   через   специальные бактериальные фильтры. В ходе проведения процесса ультрафильтрации в зависимости  от  свойств  получаемого  бактериофага  раствор   постоянно охлаждается до температуры   4-15 С.