Возбудитель холеры

5. Бактериоцины — вещества белковой природы, продуцируемые бактериями многих видов, угнетающие развитие родственных микроорганизмов;

6. В патогенезе  проявлений холеры имеет значение  также фактор, повышающий проницаемость  капилляров.

 

Холероген[5]

 

Холерный  токсин – это белковый термолабильный токсин, который выделяет Vibrio Cholerae в просвет кишечника,   является причиной интенсивного обезвоживания и диареи после начала активной фазы xолерной инфекции.

Холерный  токсин относится к широкому семейству  токсинов AB. Эти токсины характеризуются  наличием ферментативно активного домена А, ответственного за проявление токсичности, и обязательного B-домена, ответственного за вход токсина в клетку. Холерный токсин является AB5 токсином, состоит из шести полипептидов, одна - субъединица А и гомопентамер из B-субъединиц, собранный воедино до выделения из вибрионов[12].

А-субъединица  имеет массу 27 кДа и состоит из ферментативно-активной цепи А1 и цепи А2, которая связывает А-субъединицу с B-субъединицей. А-субъединица содержит серин-протеазный сайт расщепления расположенные между остатками 192 и 195, что позволяет расщеплять субъединицу до двух полипептидов: A2 и А1. Дисульфидные связи между остатками 187 и 199 удерживают эти цепи вместе. Дисульфидные связи обоих пептидов должны быть разрушены до того, как A1-цепь войдёт в цитозоль клетки-хозяина.

B-субъединица  состоит из пяти пептидов по 11,5 кДа собранных нековалентно в стабильный гомопентамер, который связывается с ганглиозидом GM1 на плазматической мембране[12]. Комплекс B-субъединица-GM1 осуществляет перенос А-субъединицы в эндоплазматический ретикулум.

Токсин  поступает в энтероцит, связываясь В-субъединицей с рецептором ганглиозидом GM1  на наружной поверхности энтороцита, и путём ретроградного эндоцитоза сначала проникает в аппарат Гольджи и в конечном итоге достигает эндоплазматического ретикулума.

Рис.2 Трехмерная структура холерного токсина. А-субъединица нековалентно связана с пентамерной B-субъединицей. A-субъединица разделяется на А1 и А2-цепи, которые соединены дисульфидными связями [5]

 

Протеолитические  расщепление комплекса связанных  А1 и А2-цепей холерного токсина происходит после выделения из холерных вибрионов в просвете кишечника. А- и B-субъединицы, однако, остается стабильно сложенными вместе, даже после того как дисульфидные связи соединяющие две цепи уменьшается. A1-цепи должны активно освобождаться от комплекса. Это достигается в просвете ЭПР редокс-зависимыми шаперонами, протеин дисульфид изомеразой (PDI). При входе в ЭПР, A-цепь CT узнаётся восстановленной формой PDI, которая связывает и разворачивает A1-цепи. В то же время, PDI-подобный белок, Erp72, работает посредником рефолдинга и удерживает А-цепь в сложенной форме. В конце концов, PDI успешно разворачивает A1-цепи. Неизвестно, что лежит в основе узнавания А-субъединицы, но предположительно оно может быть инициировано относительной нестабильностью складки-субъединицы, или, возможно, под воздействием гидрофобного C-концевого домена A1-цепи разворачивающейся изомеразой, спровоцировав тем самым ответ для утилизации неправильно свернутых белков клетки-хозяина в секреторный путь. PDI-A1-цепной комплекс, затем по-видимому, ориентирован на белки на оболочке просвета ЭПР, после чего оксидазы ER, Ero1, вероятно, окисляют PDI, чтобы вызвать освобождение A1-цепи. PDI не может быть единственным агентом ответственным за раскрытие A1-цепи. На основе экспериментальных данных полученных in vitro, предполагают, что Hsp70 Bip шаперон играет важную роль в поддержании A1-цепи в растворимой, экспортно-компетентной форме.

После этого  он маскируется под неправильно  сложенный белок с «меткой  смерти» после чего начинается его деградация и  он проходит через мембрану ЭПР находясь в процессе обратной транслокации. Белки с «меткой смерти» выводятся в цитозоль для убиквитинирования и деградации в протеасомах. Холерный токсин и другие токсины семейства АВ избежали этой участи и не быстро разлагаются после обратной транслокации, возможно, из-за нехватки остатков лизина в их первичной структуры. Вполне возможно, что цитозольные шапероны или быстрый рефолдинг A1-цепи после вступления в цитозоль позволяет избежать убиквитинирования.  В цитозоле ферментативно активный участок А1-цепи обратно сворачивается, предотвращает быструю деградацию и получает доступ к своему субстрату.

После обратной транслокации, цепь A1 входит в цитозоль в качестве активной АДФ-рибозилтрансферазы, которая изменяет α-субъединицу гетеротримерного G-белка посредством переноса АДФ-рибозильной группы с НАД . Модификация этого белка приводит к необратимой активации аденилатциклазы и быстрому производство цАМФ. В клетках кишечника, это открывает каналы для выхода в клетку xлорид-ионов, ионов натрия, калия. Увеличение концентрации xлорид-йонов вне клетки приводит к секреции клеткой воды, ионов натрия и калия, а также гидрокарбонат-иона в просвет тонкой кишки по осмотическому градиенту. Нарушение водно-солевого баланса приводит к диареи, в результате которой организм теряет до 2 литров воды в час. Происходит обезвоживание, а испражнения больного приобретают характерную консистенцию "рисового отвара" из-за отделившихся от стенки кишечника энтероцитов.

 

 

Патогенез заболевания

 

Источник  инфекции — больной человек и  вибриононосители, выделяющие огромное количество вибрионов в окружающую среду. Воротами инфекции является пищеварительный тракт. Заражение происходит при употреблении инфицированных холерным вибрионом воды и пищи, а также через загрязненные руки и предметы обихода[1]. Холерные вибрионы часто погибают в желудке вследствие наличия там соляной кислоты. Заболевание развивается лишь тогда, когда они преодолевают желудочный барьер и достигают тонкой кишки, где начинают интенсивно размножаться и выделять экзотоксин[16]. В опытах на добровольцах установлено, что лишь огромные дозы холерного вибриона (10¹¹ микробных клеток) вызывали у отдельных лиц заболевания, а после предварительной нейтрализации соляной кислоты желудка заболевание удавалось вызвать уже после введения 10⁶ вибрионов (т. е. в 100 000 раз меньшей дозой). Поэтому для дальнейшего развития инфекции играют роль кислотность желудочного сока в момент инфицирования и характер пищи, с которой вибрион попадает в желудок[16]. Наличие ахилии, гипо- и анацидные гастриты, отсутствие кислоты натощак способствуют более легкому проникновению возбудителя в кишечник и развитию заболевания[3]. Попав в тонкий кишечник, вибрионы интенсивно размножаются благодаря щелочной реакции среды и высокому содержанию основного продукта расщепления белков – пептона[3]. Быстроту их размножения в тонком кишечнике сравнивают с ростом на щелочной пептонной воде. Инкубационный период короткий: от нескольких часов до 5 сут. В течение его больные уже могут выделять возбудителя во внешнюю среду с испражнениями. Холерные вибрионы локализуются в поверхностных слоях слизистой оболочки тонкого кишечника и его просвете, где накапливается огромное количество микроорганизмов и токсических субстанций, образующихся в процессе роста и разрушения вибрионов. Холерные токсины оказывают прямое действие на эпителиальные клетки кишечника, проявляющееся резкой гиперемией, отеком слизистой оболочки, а затем некротизацией эпителиальных клеток. При этом нарушаются секреторная и всасывающая функции кишечника, ускоряется выделение воды и ионов калия из тканей в просвет кишки, что проявляется в виде профузного поноса. Грубых морфологических изменений при биопсии клеток эпителия у больных холерой выявить не удается[1]. Не удавалось обнаружить холерный токсин ни в лимфе, ни в крови сосудов, отходящих от тонкой кишки. В связи с этим нет данных о том, что токсин у человека поражает какие-либо другие органы, кроме тонкой кишки. Секретируемая тонкой кишкой жидкость характеризуется малым содержанием белка (около 1 г в 1 л), и большим содержанием электролитов: натрия – 120 ± 9 ммоль/л, калия - 19 ± 9, бикарбоната - 47 ± 10, хлоридов - 95 ± ±9 ммоль/л[16]. Потеря жидкости достигает 1 л в течение часа. В результате наступает уменьшение объема плазмы со снижением количества циркулирующей крови и ее сгущением. Происходит перемещение жидкости из интерстициального во внутрисосудистое пространство, которое не может компенсировать продолжающихся потерь жидкой безбелковой части крови. В связи с этим быстро наступают гемодинамические расстройства, нарушения микроциркуляции, которые приводят к дегидратационному шоку и острой почечной недостаточности[1]. Развивающийся при шоке ацидоз усиливается дефицитом щелочей. Концентрация бикарбоната в фекалиях в два раза превышает его содержание в плазме крови. Наблюдается прогрессирующая потеря калия, концентрация которого в фекалиях в 3-5 раз выше по сравнению с таковой плазмы крови. Если вводить достаточное количество жидкости внутривенно, то все нарушения быстро исчезают. Неправильное лечение или отсутствие его приводят к развитию острой почечной недостаточности и гипокалиемии. Последняя, в свою очередь, может вызвать атонию кишечника, гипотензию, аритмию, изменения в миокарде. Прекращение выделительной функции почек ведет к азотемии. Нарушение кровообращения в мозговых сосудах, ацидоз и уремия обусловливают расстройство функций центральной нервной системы и сознания больного (сонливость, сопор, кома)[16].

В клинической  картине различают три стадии. Первая стадия (холерный энтерит) характеризуется  частым и обильным стулом, который  приобретает вид жидкого рисового отвара. Во второй стадии (гастроэнтерит) к поносу присоединяется рвота. Рвотные  массы и испражнения содержат большое количество холерных вибрионов. Частые приступы рвоты и понос  приводят к потере больным в течение 2 суток до 40 л жидкости, вместе с которой выводится большое количество белка и солей. Это ведет к резким сдвигам в водном и солевом балансе организма. Общее состояние прогрессивно ухудшается. Развивается третья стадия (алгидная): температура тела снижается, ткани вследствие обезвоживания теряют эластичность, кожа становится серо-синюшного оттенка, глаза западают, пульс и дыхание слабые, учащенные. При отсутствии лечения болезнь заканчивается смертью примерно в 60% случаев. Кроме типичной клинической картины холеры, встречаются различные формы заболевания, начиная с бессимптомных и кончая, в редких случаях, тяжелой формой «сухой» холеры, когда больной может умереть через несколько часов при явлениях тяжелой интоксикации. Заболевания, вызываемые вибрионом Эль-Тор, протекают значительно легче[7].

 

 

 

Лабораторная диагностика

 

Постановка  диагноза при холере имеет огромное значение и должна быть проведен в кратчайшие сроки. Очень важно вовремя подтвердить диагноз болезни, выявить вибриононосителей, обнаружить холерных вибрионов во внешней среде для своевременной организации санитарно-противоэпидемических мероприятий. В зависимости от этого в лабораторию направляют для микробиологического исследования испражнения и рвотные массы больного, кусочки органов трупа, воду, пищевые продукты, предметы обихода больного.

При выделении  холерного вибриона используют его  способность быстро размножаться в  щелочной среде, опережая рост других микробов, потребность в кислороде, подвижность[7].

Основным  методом лабораторной диагностики  холеры является бактериологический, дополнительными — серологический и выделение холерных бактериофагов.

 

Этапы бактериологического  исследования[19]

Первый  этап. Микроскопия доставленного  материала. Из испражнений и рвотных масс готовят мазки, высушивают на воздухе, фиксируют смесью Никифорова и окрашивают водным фуксином или по Граму. Нередко холерные вибрионы обнаруживаются в мазках, окрашенных водным фуксином, где они расположены в виде стаек рыб. Параллельно с этим изучается подвижность вибриона в раздавленной капле. Производят посев на 1 % щелочную пептонную воду и на плотные среды (щелочной агар, TCBS). Все посевы помещают в термостат при температуре 37°С. Дают первое заключение о наличии в материале вибрионов.

Второй этап. Через 5–6 ч инкубации в термостате на пептонной воде вырастает едва видимая пленка, из которой делают мазки, препараты раздавленной капли. Пленку агглютинируют в капле О–холерной сыворотки и выдают второе заключение о природе выделенного вибриона. Пленки пересевают на вторую пептонную воду и щелочной МПА.

Третий этап. Спустя 12–16 ч от момента посева на среды испражнений больного представляется возможность повторно изучить морфологию, подвижность и агглютинабельность вибрионов пленки, выросшей на второй пептонной воде, а также провести те же исследования, отобрав с плотных сред подозрительные колонии.

Определив, что колонии состоят из вибрионов, агглютинирующихся в О–холерной сыворотке, разведенной 1:100, и в одной из типовых сывороток Инаба и Огава, разведенных 1:50, дают третье заключение о результатах исследования. Подозрительные колонии пересевают на скошенный агар для накопления культуры и определения ферментативных свойств.

Четвертый этап. Установив, какие ферменты продуцирует культура вибриона на ряде Гисса, определяют ее чувствительность к холерным фагам и дают окончательное заключение.

Учитывая  значение микробиологического исследования и его срочность, рекомендуют наряду с классические применять ускоренные методы диагностики холеры. Эти методы предусматривают ускоренное обнаружение возбудителя в исследуемом материале, ускоренную идентификацию возбудителя и выявление антител в сыворотке больных и переболевших:

• люминесцентно-серологический — выявляют свечение комплекса антиген-антитело при обработке нативного материала флюоресцирующими сыворотками (предварительный ответ получают через 30 мин — 1 ч)[18];
• иммобилизации вибрионов специфическими сыворотками при бактериоскопии в фазово-контрастном микроскопе (результат — через 15—20 мин). Холерные вибрионы теряют подвижность, склеиваются, образуя кучки[7];
• макроагглютинации вибрионов под влиянием специфической противохолерной сыворотки при подращивании нативного материала на пептонной воде (предварительный ответ — через 1,5—2 ч)[7].

Для ускоренного  обнаружения антител в сыворотке  используют метод фазово-контрастной  микроскопии, определение вибриоцидных антител, которые определяют с помощью реакции вибриоцидных антител (РВА). Принцип метода заключается в том, что в присутствии вибриоцидных антител не происходит размножение вибрионов. Вибриоцины в крови обнаруживаются с 1—3-го дня болезни[18].

Лечение

 

Решающее  значение в лечении больных холерой имеет патогенетическая терапия, направленная на быстрое и адекватное восполнение водно-электролитных потерь (по составу и объему) и с той же скоростью, с какой они происходят. Характер проводимой регидратационной терапии зависит от степени обезвоживания организма. Больным с умеренным обезвоживанием  назначается оральный прием глюкозо-солевых растворов. Больным с высокой степенью обезвоживания проводится парентеральная регидратационная терапия. Парентеральная регидратационная терапия проводится только полиионными растворами состав которых соответствует водно-электролитному составу испражнений. Учитывая скорость и объемы вводимой жидкости, они должны прогреваться до 38—40 °С[3]. С момента поступления больного в стационар необходимо учитывать у него все виды водных потерь, на основании чего определяют объем последующей регидратации. В процессе проведения регидратационной терапии необходимо контролировать водно-солевой и кислотно-основной гомеостаз.

Инфузионная регидратационная терапия проводится больным до стойкого улучшения состояния, что проявляется не только положительной динамикой параметров кардиогемодинамики, но и восстановлением диуреза, объем которого должен превышать объем испражнений за 6 часов наблюдения. Чаще всего длительность парентеральной регидратационной терапии не превышает 2-3 дня. Оральную регидратацию прекращают только после нормализации стула[1].

Помимо  патогенетической терапии больные с холерой должны получать и этиотропную терапию, проведение которой сокращает продолжительность диарейного синдрома и способствует ускорению санации организма от холерного вибриона. Также необходим прием антимикробных препаратов. Больным назначают препараты тетрациклинового ряда или фторхинолоны . При необходимости (в случае резистентности или непереносимости) могут использоваться препараты нитрофуранового ряда[3].

 

Защитный иммунный ответ

 

Защитный  иммунитет в основном обусловлен антителами, продуцируемыми местно в слизистой кишечника и выделяемыми на поверхность слизистой кишечника. Эти антитела направлены на борьбу с бактериальными компонентами, включая холерный токсин, и защищают благодаря подавлению образования колоний микроорганизма и размножения путем блокирования действия токсинов. Антитела к холерным антигенам классов IgA, IgG и IgM находятся в просвете кишки[11].

Кишечные  IgA-антитела против холерного токсина специфичны для его В-субъединицы и препятствуют развитию клинических признаков болезни путем блокирования связывания токсина с рецепторами ганглиозидами. Более того, торможение роста может произойти в результате связывания антител с микроорганизмами и воздействия на их подвижность или специфического процесса их прилипания к эпителию[25].