Причины повышения и понижения фагоцитарной активности нейтрофилов

 

СОДЕРЖАНИЕ

1. Введение………………………………………………………………………3                                        
2. Параметры, характеризующие состояние фагоцитоза…………………….4
3. Причины повышения и понижения фагоцитарной активности нейтрофилов…………………………………………………………………..5
4. Показания к применению метода…………………………………………...6
5. Технология использования метода………………………………………...10
6. Заключение………………………………………………………………….12
7. Литература…………………………………………………………………..13

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ВВЕДЕНИЕ

Метод оценки фагоцитарной активности нейтрофилов крови предназначен для комплексной диагностики  нарушений неспецифической резистентности организма в различных условиях среды обитания и профессиональной деятельности.

Изучение показателей  фагоцитоза имеет значение в комплексном  анализе и диагностике иммунодефицитных состояний: часто рецидивирующих гнойно-воспалительных процессах, длительно не заживающих ран, склонности к послеоперационным осложнениям. Исследование системы фагоцитоза помогает в диагностике вторичных иммунодефицитных состояний, вызванных лекарственной терапией.

Однако применяющиеся  в настоящее время методы оценки функ-циональной активности фагоцитов либо чрезмерно громоздки, что не позволяет эффективно применять их при массовых иммунологических исследованиях, либо не дают полноценной информации о функциональном состоянии фагоцитирующих лейкоцитов. Так, например, широко распространенный в клинической иммунологии латексный тест оценки фагоцитоза не позволяет анализировать наи-более важную функцию фагоцитов — их переваривающую (бактерицидную) активность. В то же время известно, что некоторые наиболее патогенные микроорганизмы способны персистировать в функционально дефектных фагоцитирующих клетках, разрушать их и выходить в новый жизненный цикл с соответствующими по-следствиями для организма-носителя.

В последние  годы в медико-биологических и  экологических исследованиях достаточно широко стали применяться разнообразные

методы и техника люминесцентного  анализа клеток. Этот вид анализа по своей чувствительности практически не имеет аналогов, поэтому для создания спектрального метода оценки фагоцитарной активности нейтрофилов мы применили именно этот подход.

 

 

Параметры, характеризующие  состояние фагоцитоза.

Фагоцитарное число: норма - 5-10 микробных частиц. Фагоцитарное число - среднее количество микробов, поглощённых одним нейтрофилом  крови. Характеризует поглотительную способность нейтрофилов.

Фагоцитарная ёмкость  крови: норма - 12,5-25×109 на 1 л крови. Фагоцитарная ёмкость крови - количество микробов, которое могут поглотить нейтрофилы 1 л крови.

Фагоцитарный показатель: норма 65-95%. Фагоцитарный показатель - относительное  количество нейтрофилов (выраженное в  процентах), участвующих в фагоцитозе.

Количество активных фагоцитов: норма - 1,6-5,0×109 в 1 л крови. Количество активных фагоцитов - абсолютное количество фагоцитирующих нейтрофилов в 1 л крови.

Индекс завершённости  фагоцитоза: норма - более 1. Индекс завершенности фагоцитоза отражает переваривающую способность фагоцитов. Норма — 60,0–80,0%.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Причины повышения  и понижения фагоцитарной активности нейтрофилов

Заболевания и состояния, при которых изменяется фагоцитарная активность нейтрофилов.

Повышение показателя

• Антигенное раздражение вследствие бактериального воспаления (продромальный период, период острого проявления инфекции) при нормальной активности фагоцитоза
• Лейкоцитоз
• Аллергия
• Аутоаллергические заболевания
• Усиление антителозависимой цитотоксичности и реакции на донорский трансплантат

Снижение показателя

• Хронические воспалительные заболевания бактериальной и вирусной природы
• Врождённые дефекты фагоцитарной системы, синдром Шедьяка-Хигаси, болезнь Дауна, СКВ, коллагенозы, болезни иммунных комплексов, недостаток Ig, комплемента
• Лечение цитостатиками и иммунодепрессантами
• Ионизирующее излучение
• Вторичные и первичные иммунодефициты
• Новообразования
• Тяжёлые ожоги, травмы, стресс
• Кишечные и почечные синдромы потери белка
• Недостаточность питания
• Недостаточность фагоцитоза
• Хронизация воспалительного процесса

 

 

ПОКАЗАНИЯ К  ПРИМЕНЕНИЮ метода

Метод функционального тестирования фагоцитарной активности нейтрофилов  крови рекомендуется применять  в следующих случаях:

– выявление нарушений  и отклонений в иммунной системе  при первичном клинико-лабораторном исследовании;

– динамическое наблюдение (мониторинг) за состоянием системы  иммунной защиты и организма в  целом (например, наличие стресса) на протяжении всего лечебно-диагностического процесса;

– скрининговые исследования состояния иммунной защиты и общего состояния организма у населения в различных группах риска при проведении профилактических медицинских осмотров и диагностических мероприятий.

Особенностью метода является то, что объектом фагоцитоза являются живые пекарские дрожжи S. cerevisiae. Использование именно этих дрожжей является обязательным условием выполнения метода, поскольку только живые интактные дрожжевые клетки имеют зеленую люминесценцию постоянной интенсивности при их флуорохромировании акридиновым оранжевым (АО) в низкой концентрации.

Для исследования фагоцитарной реакции нейтрофилов дрожжи S. сerevisiae удобны и интересны по нескольким причинам. Во-первых, в мире нарастает число системных микозов. Поэтому выявление дефекта фагоцитоза по отношению именно к грибам, может свидетельствовать о потенциальной уязвимости тестируемого лица к микозам. Во-вторых, в клеточной стенке S. сerevisiae содержится зимозан, поэтому они не требуют опсонизации, что значительно упрощает постановку реакции фагоцитоза. В-третьих, в силу своих размеров (3–4 мкм) они хорошо вузуализируются при микроскопии и полностью соответствуют по диаметру используемым флуоресцентным зондам.

Первые видимые изменения  у поглощенных нейтрофилами дрожжей  начинают проявляться через 15 мин  после начала инкубации в виде повышения яркости зеленого свечения. При дальнейшей инкубации зеленая люминесценция поглощенных дрожжей меняется на желтую, а затем — на ярко-оранжевую. Эта стадия переваривания протекает в течение последующих 40–45 мин. Весь процесс активного переваривания завершается через 1–1,5 ч полным лизисом поглощенных дрожжей и визуально наблюдается в цитоплазме нейтрофила в виде пустых эндовакуолей.

У непоглощенных  же дрожжевых клеток, включая аттрактированные, и у поглощенных, но не активными фагоцитами, люминесценция так и остается зеленой. При этом также и в активных фагоцитах обычно встречаются дрожжи, находящиеся на разных стадиях переваривания Очевидно, это связано с различиями в функциональном состоянии лизосомального аппарата нейтрофилов и, скорее всего, с их общим метаболизмом.

Из модельных экспериментов  и исследований различных клеток in situ известно, что АО обладает ярко выраженной способностью к метахромазии, т.е., в данном случае, способностью давать интенсивную зеленую и красную люминесценцию. Эта особенность связана с тем, что данный флуорохром способен существовать в растворе или взаимодействовать с субстратом (в первую очередь с нуклеиновыми кислотами) в форме мономеров, димеров или агрегатов более высокого порядка.

Излучение в зеленой области  спектра (λmax = 530 нм) харак-терно для мономеров АО, тогда как димеры и агрегаты этого флуо-рохрома обладают люминесценцией в красной (λmax = 640 нм) области спектра.

Обычно изучаемые клетки содержат двух- (преимущественно ДНК) и односпиральные (РНК и однонитевые участки ДНК) нуклеиновые кислоты. В низких концентрациях АО будет преимущест-венно связываться с двухспиральными нуклеиновыми кислотами, поскольку константа связывания красителя с ними значительно выше таковой с односпиральными нуклеиновыми кислотами (соответственно 2,6 × 105 и 0,29 × 105 л/моль^-1). В этих условиях молекулы АО интеркалируют между парами оснований двухспиральных нуклеиновых кислот, находящихся на значительном расстоянии друг от друга (в форме мономеров), и поэтому не способны взаимодействовать между собой. При возбуждении таких молекул именно они и люминесцируют в зеленой области спектра.

Соотношение интенсивностей красной и зеленой полос излучения окрашенных АО клеток нейтрофилов описывается безразмерным параметром α, значение которого определяется следующим уравнением (при выводе этих значений на фазовую плоскость Y/X):

α = I640 / I530 , (1)

Параметр α может характеризовать  разнообразные стороны жизнедеятельности  нейтрофилов. В частности, жизнеспособность клеток, их биосинтетическую активность или состояние лизосомного аппарата в зависимости от условий их флуорохромирования АО.

Если исследуемые клетки были предварительно фиксированы (убиты) или специальным образом обработаны, то параметр α может характеризовать отношение содержащихся в клетке односпиральных нуклеиновых кислот (НК1) к двухспиральным (НК2) и описываться следующим уравнением:

α = I640/I530 = А × НК1/НК2, (2)

где А — коэффициент пропорциональности, связанный с доступностью для красителя НК in situ. В нашем случае, когда исследуется один тип клеток (дрожжи), этот коэффициент равен 1.

Известно, что сам АО в  определенных условиях может денатурировать ДНК in situ, переводя ее из двухспиральной в односпиральную форму. Очевидно, нарастающее переваривание дрожжевых клеток лизосомными ферментами нейтрофилов дестабилизирует содержащуюся в них ДНК и облегчает ее денатурацию с соответ-ствующим изменением спектра люминесценции таких дрожжей. Не подвергающиеся перевариванию дрожжи сохраняют нативную форму своей ДНК и, соответственно, зеленую люминесценцию постоянной интенсивности.

Поскольку все исследования проводились нами при одной и  той же концентрации АО, и никакой биосинтез РНК или ДНК (тем более за такой короткий промежуток времени) в поглощенных фагоцитами дрожжах не мог осуществиться, то остается полагать, что изменение спектра люминесценции перевариваемых дрожжей связано именно с изменением конформации ДНК in situ.

Однако одиночные спектры  люминесценции поглощенных дрожжей малоинформативны для популяционного анализа функционального состояния нейтрофилов. Для этих целей более целесообразно применять двухволновую микрофлуориметрию. Этот вид люминесцентного анализа позволяет выводить на фазовую плоскость в виде точки в координатах интенсивностей зеленой и красной люминесценции (X и Y) на максимумах эмиссии сигналы любого количества клеток различного типа и видовой биологической принадлежности. Результаты визуального наблюдения и анализа во многом совпадают с результатами инструментального.

За неимением соответствующей  техники анализ может быть проведен визуально с использованием стандартного люминесцент-ного микроскопа (люминесцентной приставки).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ТЕХНОЛОГИЯ  ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА

Предметом анализа являются нейтрофилы из нефракционированной венозной крови.

Объектом фагоцитоза служат обычные живые пекарские дрожжи S. cеrevisiae.

Предварительная подготовка к постановке реакции  фагоцитоза осуществляется следующим  образом: 2 г сухих пекарских дрожжей растворяют в 100 мл физиологического раствора в течение 1 ч с помощью магнитной мешалки, затем суспензию выдерживают 30 мин на водяной бане при 25° С и фильтруют через 3–4 слоя марли. После фильтрации смесь разливают в пластиковые пробирки по 1,0 мл и замораживают для длительного хранения. Суспензия пекарских дрожжей хранится при –18° С в течение 12 мес.

Непосредственно перед постановкой  реакции 1,0 мл суспензии дрожжей  размораживается и 3 раза отмывается физиологическим раствором путем  центрифугирования при 1000 об./мин по 5 мин.

Для приготовления рабочей  концентрации дрожжей к 0,1 мл осадка добавляют 9,9 мл физиологического раствора.

Затем, после естественной седиментации эритроцитарной массы (не менее 40 мин) в пробирке с венозной кровью, у границы раздела фаз отбирается 0,5 мл плазмы, содержащей все фракции клеток белой крови, и добавляется 0,5 мл 1% приготовленной суспензии дрожжей. Пробирку встряхивают и центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об./мин. После этого ее инкубируют при 37° С в течение 40 мин.