Противоишемическое и эндотелиопротективное действие потенцированных антител к энлотелиальному фактору роста сосудов

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

 

Опыты проводились на белых крысах-самцах линии Wistar массой  
250-300 г. N-нитро-L-аргинин метиловый эфир (L-NAME) вводился ежедневно один раз в сутки, внутрибрюшинно, в дозе 12,5 мг/кг/сут. На 29 день от начала эксперимента под наркозом (хлоралгидрат 300 мг/кг) вводили катетер в левую сонную артерию для регистрации показателей артериального давления (АД), болюсное введение фармакологических агентов осуществляли в правую бедренную вену. Показатели гемодинамики: систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряют непрерывно посредством датчика TSD104A и аппаратно-программного комплекса MP100, производства Biopac System, Inc., США. Функциональные пробы: эндотелийзависимая вазодилатация - внутривенное введение ацетилхолина (АХ) в дозе 40 мкг/кг (Laursen J.B., 1997), эндотелийнезависимая вазодилатация – внутривенное введение нитропруссида натрия (НП) в дозе 30 мкг/кг (Галаган М.Е., 1991).

Исследование сократимости миокарда после моделирования патологии  проводили у наркотизированных  крыс, находящихся на управляемом  дыхании. Полость левого желудочка  зондировали иглой через верхушку сердца и посредством TSD104A и аппаратно-программного комплекса MP100, производства Biopac System регистрировали показатели кардиогемодинамики (левожелудочковое давление (ЛЖД), максимальную скорость сокращения (+dp/dt max), максимальную скорость расслабления (-dp/dt max), ЧСС и интенсивность функционирования структур (ИФС) (произведение ЧСС и давления, развиваемого левым желудочком (мм рт. ст. х уд. мин).

Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных проводили  нагрузочные пробы в представленной последовательности:

1. Нагрузка объёмом (внутривенное одномоментное введение 0,9 % раствора NaCl, из расчёта 0,4 мл на 100 г) (Тюренков И.Н., 2005).
2. Проба на адренореактивность (внутривенное одномоментное введение раствора адреналина гидрохлорида 10^-5моль/л, из расчёта 0,1 мл на 100 г) (Меерсон Ф.З., 1980).
3. Нагрузка сопротивлением (пережатие восходящей аорты на 30 сек (Меерсон Ф.З., 1980).
4. 3-минутную гипоксию (Пашин Е.Н., 1993).

 

Биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции. Использована модификация метода определения стабильных метаболитов NO (Метельская В.А., Гуманова Н.Г., 2005).

Моделирование хронической ишемии задней конечности. Осуществляли под наркозом хлоралгидрат в дозе 300 мг/кг после соответствующей подготовки кожи. Затем производили разрез по внутренней поверхности области бедра. Рассекали собственную фасцию. Выделяли элементы основного сосудисто-нервного пучка бедра. Бедренную артерию отделяли от вены и нерва, мобилизовали. Затем накладывали лигатуры на артерию в месте ее начала и пересекали. Перевязывали и пересекали a. saphena. Выделяли подко-ленную артерию и начальные отделы артерий голени, которые пересекали. Участок магистрального сосуда, включающий бедренную, подколенную артерию и начальные отделы артерий голени удаляли. Рану на бедре послойно ушивали непрерывным швом.

Данная модификация  модели приводит к развитию ишемии более тяжёлой степени. Методика моделирования описана в работах S. Takeshita et. al.

Оценка уровня микроциркуляции  в мышцах голени крыс осуществлялась методом лазерной доплеровской флоуметрии (ЛДФ). Исследование осуществляли при помощи аппарата - лазерный доплеровский флоуметр «Biopac-systems MP 100» и датчика «TSD-144». Исследование проводили под наркозом хлоралгидрат (300 мг/кг). После наступления наркотического сна иссекали участок кожи в передне-наружном участке области правой голени до собственной фасции. Датчик вплотную приставляли к мышце и проводили запись кривой микроциркуляции. Уровень микроциркуляции регистрировали в пяти точках: 1) середина длины мышцы, точка на 3-4 мм 2) выше, 3) ниже,  
4) латеральнее, 5) медиальнее относительно первой. Запись кривой микро-циркуляции проводили в течение 30 сек в каждой точке. Из полученных пяти значений выводили среднее, которое принимали за уровень микроциркуляции в мышцах голени у данного животного.

Методы морфологического исследования. Для морфологического исследования после выведения животных из эксперимента производили забор материала органов: сердце, почки, участок мышцы голени. Материал фиксировали в 10% растворе формалина. Сердца рассекали через середину во фронтальной плоскости в виде пластин толщиной 2 мм, в которых содержались оба предсердия, правый и левый желудочки, межжелудочковая перегородка. Кусочки почек вырезали в поперечном направлении строго через центральную часть, включающую почечный сосочек. Окраску срезов гематоксилином и эозином производили в автоматическом режиме в автостейнере HMS 740 (Microm Int. GmbH, Германия). Определяли диаметры кардиомиоцитов левого желудочка, кровеносных сосудов, в почках измеряли диаметры почечных клубочков. Просмотр, анализ и морфометрию осуществляли с помощью программы просмотра и анализа изображений Mirax Viewer 1.12.

Дизайн эксперимента. Исследована эндотелиотропная и противоишемическая активность потенцированных антител к эндотелиальному фактору роста сосудов VEGF в сравнении со СМД антител к eNOS.

Данные разведения крысы получали внутрижелудочно из расчёта  
9 мл/кг/сут. В хроническом эксперименте при моделировании L-NAME-опосредованного дефицита NO смеси растворов гомеопатических разведений вводились ежедневно в дозе 4,5 мл/кг 2 раза в сутки в течение 28 дней через  
30 минут после введения L-NAME.

С целью коррекции  экспериментальной ишемии конечности исследуемые гомеопатические разведения вводили в дозе 4,5 мл/кг 2 раза в сутки в течение 28 дней. Доза 9 мл/кг/сут. внутрижелудочно ежедневно в виде смеси гомеопатических разведений С12+С30+С200 выбрана нами в сотрудничестве с «Материа Медика», исходя из максимально допустимого объёма жидкости при внутрижелудочном введении лабораторному животному.

Принятая схема соответствует  основной массе экспериментальных  исследований на лабораторных крысах.

Достоверность наблюдавшихся  при действии исследованных препаратов изменений параметров, как абсолютных, так и в приростах от исходного  уровня, определяли разностным методом описательной статистики с нахождением средних значений сдвигов (М), средней ошибки средней арифметической (±m) и вероятности возможной ошибки (р), рассчитанной с использованием t-test для групп с различной дисперсией. Различия оценивали как достоверные при р<0,05. Статистические расчеты проводились с использованием программы Microsoft Excel 2003.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Динамика функциональных, биохимических и морфологических показателей при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита NO.

Длительное, в течение 28 суток, однократное внутрибрюшинное  введение L-NAME в дозе 12,5 мг/кг привело к стойкому повышению артериального давления (рис. 1).

Проведение функциональных проб с оценкой реакции на эндотелийза-висимое и эндотелийнезависимое расслабление показало существенные отличия в группе с L-NAME-индуцированной патологией в отличие от интакт-ных животных. На рисунке 2а – верхняя кривая – АД систолическое, далее – АД диастолическое и ЧСС. Реакция на введение ацетилхолина характеризуется резким падением АД и брадикардией. После окончания миокардиального компонента АД восстанавливается. Треугольник над кривой восстановления АД рассматривался как площадь эндотелиальной реакции.

На рис. 2б представлена реакция на ацетилхолин при моделировании  
L-NAME-индуцированной ЭД. При этом видно, что площадь эндотелий-зависимой реакции в несколько раз меньше, чем у интактных животных.

Аналогично оценивали  эндотелийнезависимую реакцию на нитропруссид. Обращает на себя внимание отсутствие принципиальной разницы в площадях эндотелийнезависимых реакций у интактных и опытных групп, несмотря на существенно более высокие цифры АД (рис. 3).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 1. Функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита NO.

Примечание: * - р < 0,05 в  сравнении с группой интактных  животных.

 

а) интактные животные

б) животные с патологией

Рис. 2. Кривые САД, ДАД, ЧСС при проведении функциональной пробы на  эндотелийзависимую вазодилатацию (внутривенное введение ацетилхолина  
40 мкг/кг) у интактных животных.

Треугольники над кривой артериального давления - объяснение по тексту.

 

а) интактные животные

б) животные с патологией

Рис. 3. Кривые САД, ДАД, ЧСС при проведении функциональной пробы на  эндотелийнезависимую вазодилатацию (внутривенное введение нитропруссида натрия 30 мкг\кг) у интактных животных.

Треугольники над кривой артериального давления – объяснение по тексту.

 

Математическое выражение  описанного явления представлено нами в виде коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), являющегося отношением площади среднего артериального давления на нитропруссид к площади среднего артериального давления на ацетилхолин.

В наших экспериментах  КЭД в группе интактных животных составил 1,2, при L-NAME-индуцированном дефиците NO – в 3 раза больше: его значение составило 3,5 (рис. 1).  L-NAME-индуцированный дефицит NO привёл к увеличению абсолютных значений ЛЖД в пробе на адренореактивность и снижению миокардиального резерва в пробе нагрузки сопротивлением (рис. 1). У интактных животных ЛЖД к 25 секунде снижалось до 93,9%, а у животных с L-NAME-индуцированной патологией  значительно сильнее – до 67,5%.

Характерная динамика биохимических маркеров L-NAME-индуцированного дефицита NO представлена на рис. 1. Обнаружено, что моделирование L-NAME-индуцированной патологии приводило к снижению содержания нитрит-ионов в 3 раза.

Подтверждением функционально-биохимических показателей, отражающих развитие L-NAME-индуцированной ЭД, явились результаты морфологических исследований (рис. 4). На представленных гистологических препаратах, рис. 4а – интактные миокардиоциты, рис. 4б – миокардиоциты животных на 28-е сутки с L-NAME-индуцированной патологией. Наглядно видно, что площадь поперечного сечения резко увеличена при сохранённом диаметре ядер при одном увеличении. Морфометрические исследования показали, что у интактных животных поперечное сечение составило 9,91 мкм, а у животных, получавших L-NAME, – 15,14 мкм (рис. 1).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 4. Морфология миокарда у интактных и опытных животных:  
А – гистологическая картина миокарда у интактных крыс на поперечном срезе; Б – гипертрофия кардиомиоцитов и их ядер у крысы с артериальной гипертензией в модели с L-NAME на поперечном срезе. Окр. гематоксилином и эозином. Ув.х400.

 

Аналогично прослеживалась морфологическая картина изменений сосудистой стенки почечных артерий (рис. 5). У интактных животных (а) – клетки эндотелия расположены плоско, при L-NAME-патологии (б) – сосуд спазмирован, стенки утолщены, эндотелий «вздыблен».

Таким образом, ежедневное в течение 28-ми суток внутрибрюшинное введение L-NAME в дозе 12,5 мг/кг массы тела животного вызывает развитие ЭД, характеризующейся резким увеличением КЭД, АД, повышением адренореактивности, характерными биохимическими сдвигами и гистоло-гической картиной гипертрофии миокарда и гиперплазии сосудистого русла.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 5. Морфологическая картина крупных почечных артерий у интактных и опытных животных: А – неизмененная артерия почки у интактной крысы;  
Б – перестройка стенки почечной артерии с резким утолщением ее стенки и сужением просвета, гиперплазией эластических структур и гипертрофией гладкомышечных элементов у крысы с артериальной гипертензией в модели с L-NAME. Окр. гематоксилином и эозином. Ув.х400.

 

2. Исследование эндотелиопротективной активности потенциро-ванных антител к VEGF и потенцированных антител к eNOS при  
L-NAME-индуцированной модели дефицита NO в эксперименте.

Наши исследования показали, что потенцированные антитела к VEGF и потенцированные антитела к eNOS обладают выраженным эндотелио-протективным эффектом. Так, КЭД у интактных животных составил – 1,2, с  
L-NAME патологией – 3,5, L-NAME + потенцированные антитела к VEGF – 1,7, L-NAME + потенцированные антитела к eNOS – 1,8 (рис. 6).

 Отмечено, что данные гомеопатические разведения слабо предотвращали повышение адренореактивности, вызванное L-NAME-индуцированной патологией. У интактных животных показатели сократимости левого желудочка сердца составили 199,8 мм рт.ст., у L-NAME – 281,1 мм рт.ст., в группе с коррекцией потенцированными антителами к VEGF – 273,9 мм рт.ст., в группе с коррекцией потенцированными антителами к eNOS – 269,4 мм рт.ст.

При проведении пробы на нагрузку сопротивлением приём исследуемых растворов гомеопатических разведений предотвращал падение сократимости с 5 на 25 секунду пережатия аорты (рис. 6). Сократимость на 25 сек нагрузки составила у интактных животных – 93,9% к 5-й сек, взятой за 100%. L-NAME-индуцированная патология – 67,5%, с коррекцией потенцированными антителами к VEGF – 97,1%, с коррекцией потенцированными антителами к eNOS – 105,6%.