Противоишемическое и эндотелиопротективное действие потенцированных антител к энлотелиальному фактору роста сосудов

 

 

  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 6. Влияние смеси растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF (9 мл/кг/сут.) и СМД антител к eNOS (9 мл/кг/сут.) на функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита NO.

**- р < 0,05 в сравнении с группой L-NAME животных,

* - р < 0,05 в сравнении с группой интактных животных.  

 

Результаты исследования функционального состояния миокарда при проведении нагрузочных проб выявили отчетливое кардиопротективное действие смеси растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF – С12, С30, С200 (9 мл/кг/сут.) и СМД антител к эндотелиальной NO-синтазе (смеси гомеопатических разведений С12+С30+С200) (9 мл/кг/сут.), выражающееся в предотвращении падения ЛЖД при проведении пробы на нагрузку сопротивлением и увеличении сократимости на пике реоксигенации по сравнению с животными у которых моделировали L-NAME - индуцированный дефицит NO (для потенцированных антител к eNOS).

Концентрация нитрит-ионов под влиянием исследуемых гомеопатических разведений увеличивалась и статистически достоверно не отличалась от показателей интактных животных (рис. 6).

Исследуемые гомеопатические  разведения статистически достоверно предотвращали увеличение поперечного диаметра миокардиоцитов (рис. 6). Одновременно более благоприятная картина морфологических изменений под влиянием коррекции обнаруживалась в почках.

Таким образом, смесь растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF – С12, С30, С200 (9 мл/кг/сут.) и смесь растворов сверхмалых доз антител к eNOS (гомеопатические разведения С12, С30, С200) (9 мл/кг/сут.) проявляли выраженное эндотелиопротективное действие на 28-дневной модели L-NAME-индуцированного дефицита NO, что выражалось в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении КЭД до уровня интактных животных, а также в полном предотвращении снижения содержания нитрит-ионов. Результаты нагрузочных проб выявили улучшение показателей сократимости в пробе «нагрузка сопротивлением». Морфологические исследования обнаружили предотвращение под влиянием данных гомеопатических разведений увеличения поперечного диаметра миокардиоцитов у животных с L-NAME-индуцированной патологией.

 

3. Исследование влияния потенцированных антител к VEGF и потенцированных антител к eNOS на уровень микроциркуляции и ангиогенез при коррекции ишемии конечности в эксперименте.

Данная экспериментальная  работа проведена на 50 крысах-самцах линии «Wistar», половозрелых, массой 250-350 г. У лабораторных животных оценивали уровень микроциркуляции методом лазерной доплеровской флоуметрии и морфологическую картину в мышцах задней конечности.

Среднее значение уровня микроциркуляции в наружной группе мышц правой голени в интактной группе крыс составило 525,7±9,8 п.е. (перфузионных единиц). Уровень микроциркуляции в правой и левой мышцах голени животных не отличался друг от друга (р>0,05). Данное значение было принято в качестве исходной нормы. Среднее значение уровня микроциркуляции в наружной группе мышц правой голени в группе ложнооперированных крыс составляет на 28 сутки 531,8±12,8 п.е. Результаты достоверно не отличается от данных, полученных в группе интактных животных (р>0,05).

При морфологическом  изучении мышц голени интактной группы животных получена следующая картина. Мышечные волокна в препарате располагаются плотно друг к другу, соединительная ткань (строма) между волокнами не выражена. Присутствуют сосуды микроциркуляторного русла, иногда в препарате оказываются более крупные сосуды (артериолы, мелкие артерии, венулы) (рис. 7).

При осмотре контрольной группы животных после операции моделирования ишемии у всех животных были отмечены признаки острой ишемии оперированной конечности. Имели место ишемический отёк, боль в конечности, что проявлялось неучастием конечности в передвижении, а также агрессивной реакцией крысы на касание инструментом до больной конечности.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 7. Морфологическая картина мышц голени интактного животного.

Примечание: миоциты, соединительнотканные прослойки между волокнами, в  перимизии сосудистый пучок с  умеренным кровенаполнением. Окр. гематоксилином и эозином. Ув.х200

 

С течением времени появлялись признаки формирующейся хронической ишемии конечности, что характеризовалось наличием таких патогномоничных симптомов, как перемежающаяся хромота, трофические расстройства в дистальных участках конечности.

В контрольной группе животных на 28-е сутки мышца выглядела несколько гипотрофичной. При гистологическом исследовании наблюдаются участки резорбируемого некроза (рис.8), а в микроциркуляторном русле отмечались полнокровие и новообразование единичных капилляров.

Результаты оценки уровня микроциркуляции у животных на 28 сутки при моделировании ишемии конечности и ее коррекции смесью растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF – С12, С30, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. и смесью растворов гомеопатических разведений поликлональных кроличьих антител к eNOS – С12, С30, С200 в дозе  
9 мл/кг/сут. представлены в таблице 1. Уровень микроциркуляции после операции моделирования ишемии задней конечности составил на 28 сутки 361,3 ±8,7 п.е., что достоверно ниже значения в группе интактных (р<0,001) и ложнооперированных животных (р<0,001).

На фоне коррекции  патологии потенцированными антителами к VEGF уровень микроциркуляции достоверно возрастает до 486,1 ±18,8 п.е. ( р<0,05).

При коррекции патологии потенцированными антителами к эндоте-лиальной синтазе оксида азота уровень микроциркуляции достоверно возрастает до 490,3±18,6 п.е. ( р<0,05).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 8. Морфологическое исследование мышц голени крыс. Животное контрольной группы, 28 сут. эксперимента. Небольшой участок органи-зующегося некроза, в его центре остатки резорбируемых некротизированных мышечных волокон. Окр. гематоксилином и эозином. Ув.х140.

Таблица 1

Результаты оценки уровня микроциркуляции  в мышцах голени на 28 сутки (М±m), п.е. (перфузионные единицы)

Интактные (n=10)	525,7 ±9,8
Ложнооперированные (n=10)	531,8±12,8
Ишемия конечности (n=10)	361,3 ±8,7*
Ишемия конечности + смесь р-ров потенцированных антител к eNOS – С12, С30, С200 (n=10)	490,3±18,6**
Ишемия конечности + смесь р-ров потенцированных антител к VEGF – С12, С30, С200 (n=10)	486,1 ±18,8**

 

Примечание: * - р<0,05 в  сравнении с интактными;  ** - р<0,05 в сравнении с группой с ишемией конечности

При макроскопической оценке мышцы ишемизированной голени в  группах с фармакологической  коррекцией патологии не отличались по цвету и виду от мышц интактных крыс. При гистологическом исследовании в  данных группах некротические изменения и остаточные явления в виде очагов грануляционной или рубцовой ткани не выявлены. Мышечные волокна имели сохранную общую структуру. Саркоплазма характеризовалась однородной окраской, ядра расположены равномерно и типично на периферии. При визуальной оценке степени васкуляризации мышц выявляется относительно равномерное кровенаполнение сосудов различного диаметра. В обеих группах животных очагово выявлена большая концентрация ядер эндотелиальных клеток, что отражает картины формирования капиллярных почек новообразующихся капилляров (рис. 9).

Таким образом, полученные результаты позволяют констатировать эффективность фармакологической коррекции ишемии конечности исследуемыми растворами гомеопатических разведений антител за счет стимуляции неоангиогенеза.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 9. Морфологическая картина мышц голени на 28-е сутки эксперимента. Группы животных с коррекцией ишемии: А- потенцированными антителами к VEGF; Б- потенцированными антителами к eNOS. Мышечные волокна в обеих группах в различных участках равномерного диаметра, тинкториальные свойства саркоплазмы без отличий от интактных животных, между мышечными волокнами очаги скопления ядер эндотелиальных клеток новообразованных капилляров (на стрелках). Окр. гематоксилином и эозином. Ув.х400. 

 

ВЫВОДЫ

 

1. Ежедневное введение N-нитро-L-аргинин метилового эфира (L-NAME) в дозе 12,5 мг/кг в течение 28-ми суток однократно внутрибрюшинно вызывает у крыс-самцов развитие эндотелиальной дисфункции, выражающейся в увеличении коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) в 3 раза по сравнению со значениями в интактной группе животных; развитие артериальной гипертензии (204,8 / 164,2 мм.рт.ст.); вызывает снижение содержания нитрит-ионов, снижение показателей сократимости при проведении пробы «нагрузка сопротивлением» и гипертрофию кардиомиоцитов.

2. Смесь растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF – С12, С30, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. проявляет эндотелиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированного дефицита NO в течение 28-ми суток, что выражается в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении КЭД до уровня интактных животных, а также в предотвращении снижения содержания нитрит-ионов. Результаты нагрузочных проб выявили улучшение показателей сократимости в пробе «нагрузка сопротивлением». Морфологические исследования обнаружили предотвращение под влиянием данных гомеопатических разведений увеличения поперечного диаметра миокардиоцитов у животных с L-NAME – индуцированной патологией. Монотерапия данными гомеопатическими разведениями в изученных дозах не позволяла достичь целевых значений АД.

3. Смесь растворов гомеопатических разведений поликлональных кроличьих антител к эндотелиальной синтазе оксида азота – С12, С30, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. проявляет эндотелиопротективное действие на 28-дневной модели L-NAME-индуцированного дефицита NO, достоверно не отличающееся от действия потенцированных антител к VEGF по совокупности функциональных, биохимических и морфологических показателей. Значения КЭД, АД, поперечного диаметра миокардиоцитов, содержания нитрит-ионов не показали достоверных отличий по сравнению с соответствующими значениями  в группе животных, получавших смесь растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF – С12, С30, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. В пробе на адренореактивность коррекция потенцированными антителами к VEGF в меньшей степени предотвращала развитие гиперадренореактивности, чем коррекция потенцированными антителами к eNOS.

4. Смесь растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF – С12, С30, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. увеличивает показатели микроцикуляции в ишемизированной конечности на 28-е сутки за счет уменьшения очага некроза и стимуляции неоангиогенеза. На фоне фармакологической коррекции ишемии мышцы голени уровень микроциркуляции достоверно возрастает до 486,1 п.е. (р<0,05) по сравнению со значениями в контрольной группе животных (361,3 п.е.).

5. При коррекции ишемии конечности смесью растворов гомеопатических разведений поликлональных кроличьих антител к eNOS – С12, С30, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. уровень микроциркуляции достоверно возрастает до 490,3 п.е. (р<0,05) по сравнению с данными контрольной группы (361,3 п.е.) и достоверно не отличается от уровня микроциркуляции в группе с коррекцией потенцированными антителами к VEGF (486,1 п.е.). Результаты подтверждаются данными морфологического исследования: в мышцах ишемизированной голени некротические изменения не обнаруживались, отмечалось усиленное новообразование капилляров, что подтверждает положительное влияние исследуемых гомеопатических разведений на ангиогенез в ишемизированной мышце. Достоверных различий в эффективности противоишемического действия исследуемых гомеопатических разведений не обнаружено.

 

Список работ, опубликованных по теме диссертации

 

1. Потенцированные разведения антител к эндотелиальному фактору роста / А. С. Белоус, О. С. Гудырев, А. А. Арустамова [и др.] // Материалы IV международной научной конференции молодых учёных-медиков, Курск, 25-26 февр. 2010 г. : 3 т. / Курск. гос. мед. ун-т, Воронеж. гос. мед. акад. [и др.] ; под ред. В. А. Лазаренко. – Курск, 2010. – Т. 1. – С. 88-89.
2. Актуальность создания нового препарата на основе потенцированных разведений антител к эндотелиальному фактору роста / А. С. Белоус,  
   О. С. Гудырев, А. А. Арустамова [и др.] // Актуальные вопросы фармакологии и фармации : сб. тр. межвуз. науч. конф., посвящ. памяти проф. В. В. Пичугина и 75-летию КГМУ, Курск, 25 дек. 2009 г. / Курск. гос. мед. ун-т. Центр.-Чернозем. науч. центр РАМН, РАЕН, Всерос. об-во фармакологов-токсикологов. – Курск, 2009. – С. 108-109.
3. Перспективы создания нового препарата на основе потенцированных разведений антител к VEGF / А. С. Белоус, М. В. Покровский,  
   А. А. Арустамова [и др.] // Человек и лекарство : XVII Рос. нац. конгр., Москва, 12-16 апр. 2010 г. : сб. материалов конгр. (тез. докл.). – М., 2010. –  
   С. 578-579.
4. Коррекция гипоэстроген-индуцированной эндотелиальной дисфункции препаратом импаза в комплексе с эналаприлом и лозартаном /  
   А. С. Белоус, М. В. Покровский, А. А. Арустамова [и др.] // Физиология и патология иммунной системы. Иммунофармакогеномика. – 2010. – Т. 14,  
   № 4. – С. 3-6. (Перечень ВАК)
5. Способ коррекции гипергомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции смесью растворов гомеопатических разведений поликлональных кроличьих антител к эндотелиальной синтазе оксида азота человека – С12, С30, С200 / А. А. Арустамова, А. С. Белоус, М. В. Покровский [и др.] // Инновации в медицине : материалы 3 междунар. дистанц. науч. конф. / КГМУ, Центр.-Чернозем. науч. центр РАМН, Общерос. обществ. орг. «Рос. союз молодых учёных» ; под ред. В. А. Лазаренко, П. В. Калуцкого. – Курск, 2010. – С. 12-16.
6. Воспроизведение стрептозотоцин-индуцированной эндотелиальной дисфункции у крыс / А. И. Маяков, М. В. Покровский, А. А. Арустамова [и др.] // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. – 2010. – № 22,  
   вып. 12. – С. 56-63. (Перечень ВАК)
7. Эндотелиопротективные, кардиопротективные эффекты аторвастатина и его комбинаций с L-аргинином и резвератролом в эксперименте /  
   Т. В. Долженкова, В. И. Якушев, А. А. Арустамова [и др.] // Кубанский научный медицинский вестник. – 2010. – № 7. – С. 61-65. (Перечень ВАК)
8. Устройство для дистантного прекондиционирования : пат. на полезную модель 97615 Рос. Федерация : МПК А61В17/12. / О. О. Новиков,  
   М. В. Покровский, В. И. Кочкаров [и др.] ; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО «Белгор. гос. ун-т». – № 2010110708/22 ; заявл. 23.03.2010 ; опубл. 20.09.2010, Бюл. № 26. – 6 с.