Пути обеспечения и методы оценки апирогенности парентеральных лекарственных форм

Государственная фармакопея XI издания устанавливает критерий признания препарата пирогенным либо апирогенным: воду или раствор лекарственного средства считают апирогенным, если сумма максимальных повышений температур у 3 кроликов не превышает 1,4°С, и пирогенным, если она равна или больше 2,2°С. Если сумма повышений температуры у 3 кроликов в пределах от  1,5°С до 2,2°С, то испытание повторяют на 5 кроликах. В таком случае воду или раствор лекарственного средства считают пирогенным, если сумма повышений температуры у 8 кроликов равна или больше 3,8°С. По Европейской Фармакопее препарат считают апирогенным, если сумма повышений температур у трех кроликов не превышает 1,15°С, при сумме повышений в пределах от 1,15 до 2,65°С испытание повторяют на 6 кроликах, при превышении 2,65°С препарат признают пирогенным.[13]

По ГФ XII интерпретацию результатов проводят в соответствии с таблицей 1:

Табл.1 Оценка результатов теста на пирогенность по ГФ XII [3]

 

В последнее время заметное распространение получает метод испытания лекарственных средств на наличие бактериальных эндотоксинов in vitro (LAL-тест). Метод основан на реакции взаимодействия лизата амебоцитов краба Limulus polyphemus или Tachypleus tridentatus с бактериальными эндотоксинами с образованием геля. Метод включен в Европейскую Фармакопею и Фармакопею США, а также в ГФ XII.

Европейская Фармакопея предлагает 3 варианта этого теста: 1) гель-тромб тест (по образованию геля); 2) турбидиметрический тест (по степени мутности); 3) колориметрический тест (по интенсивности окраски образующегося белкового комплекса). Для реализации этих вариантов разработаны 6 методов: методы А и В в технике гель-тромб, С и F – турбидиметрические, D и Е – колориметрические, причем методы B,C,D,E и F позволяют количественно определить содержание пирогенов. В общем случае, когда в частной фармакопейной статье нет указаний о том, каким методом проводить LAL-тест, используют метод А, не являющийся количественным. Также в случае расхождения результатов, полученных разными методами, окончательный вывод делают по результатам метода А. Государственная фармакопея XII издания предлагает два метода – качественный анализ (А) и количественный (В).

Для проведения испытаний используют раствор лизата амебоцитов краба Лимулюс в воде или буферных растворах, также возможно использование лизата в виде лиофилизированного порошка. Лизат помимо бактериальных эндотоксинов может реагировать с некоторыми β-глюканами; чтобы исключить возможность такого взаимодействия из лизата удаляют G-белок или ингибируют его. Вода, используемая в данном методе – вода высокой степени очистки или другие категории воды, предварительно прошедшей испытания на отсутствие реакции с лизатом.

Оптимальный диапазон значений рН для проведения теста составляет 6,0 – 8,0. Некоторые вещества не могут быть подвергнуты непосредственному испытанию, так как они неустойчивы в данном интервале рН, не смешиваются с реагентами или влияют (активируют/ингибируют) на образование геля, в таких случаях может потребоваться предварительная пробоподготовка. Все реагенты и материалы, используемые в анализе, как и воду, подвергают предварительному испытанию на отсутствие реакции с лизатом, во избежание ложноположительных результатов теста.

Для проведения испытания методом А готовят 4 раствора, как указано в таблице 2:

Проба	Концентрация эндотоксина	Раствор, к которому добавляют эндотоксин	Число проб
А	-	Разведение испытуемого раствора	2
В	2λ	Разведение испытуемого раствора	2
С	2λ	Вода для теста на бактериальные эндотоксины (апирогенная вода)	2
D	-	Вода для теста на бактериальные эндотоксины (апирогенная вода)	2

 

Табл.2 Серия растворов для проведения LAL-теста

λ – экспериментально установленная чувствительность лизата, т.е. минимальная концентрация эндотоксина, которая дает реакцию образования геля с раствором лизата (IU/мл)

Максимальное разведение (МДР) испытуемого раствора определяется формулой:

          МДР = ,        где предельная концентрация эндотоксина = ,  (К – предельная доза эндотоксина, вызывающая пирогенную реакцию, М – высшая терапевтическая доза препарата; измеряется в IU/мл, IU/мг, IU/ЕД).

Готовят по 2 раствора каждой пробы (А, В, С, D), чтобы повторить испытание 2 раза с целью повышения точности результата.

Пробы В и С – положительный контроль, они подтверждают активность лизата (проба С) и отсутствие мешающих факторов в испытуемом растворе (проба В). Раствор D – отрицательный контроль, подтверждает отсутствие пирогенов в воде, взятой для анализа.

В каждую пробу добавляют равный объем раствора лизата (по 0,1 мл), термостатируют все пробы в укупоренных контейнерах при 37±1°С в течение 60±2 мин, затем контейнеры вынимают из термостата и проверяют, образовался ли гель, переворачивая каждый контейнер  на 180°.

Испытание считается достоверным, если по его результатам обе пробы В и С дали положительный результат, а обе пробы D – отрицательный. Препарат считается апирогенным при отрицательном результате в обеих пробах А.

По Европейской Фармакопее для парентеральных лекарственных средств предусматривается либо проведение теста на бактериальные эндотоксины (LAL-тест) либо проведение теста на пирогены (испытание на кроликах). В частной статье на лекарственный препарат указывается, какой метод следует использовать; при отсутствии указаний, предпочтительным считается LAL-тест. Этот метод имеет ряд преимуществ перед испытанием на кроликах: он чувствительнее в 5-10 раз, результат получается быстрее, возможно количественное определение пирогена. Кроме того, с его помощью возможен контроль препаратов, которые нельзя испытать на кроликах. Одним из недостатков этого метода является его специфичность в отношении эндотоксина грамотрицательных бактерий, т.е. опасность не уловить наличие в лекарственных средствах пирогенов другого происхождения.[3;14]

 

 

Заключение

 

Проблема апирогенности лекарственных средств и материалов для их изготовления, в том числе получения апирогенной воды, очень современна и актуальна. Постоянно совершенствуются методы обнаружения пирогенов, о чем свидетельствует распространение LAL-теста в различных вариантах, включая методики количественного определения, взамен стандартного испытания на пирогенность с использованием кроликов. Также разрабатываются все новые и новые методы депирогенизации. Наиболее перспективными в этом направлении являются физические методы с использованием ультрафильтрации, так как они надежны, высокоэффективны, применимы для широкого круга веществ (в отличие от химических методов). Использование установок ультрафильтрации позволяет значительно сократить производственные площади, так как они компактны и позволяют обеспечить полную автоматизацию производства. Еще одним достоинством данных модулей является их низкое энергопотребление, что уменьшает издержки на производство препаратов, и соответственно их стоимость для пациента. Технология ультрафильтрации постоянно совершенствуется – идет поиск новых материалов для изготовления мембран, способных повысить их механическую и химическую стойкость; разрабатываются новые конфигурации установок для расширения области их применения и обеспечения наиболее эффективной работы в заводских условиях. Таким образом, есть основания считать, что данный метод депирогенизации в ближайшее время будет все шире применяться в технологии парентеральных лекарственных форм, заменяя устаревшие методы, связанные с использованием химических реагентов и активированного угля.

 

 

 

 

 

 

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

 

1. Аквафор Трейдинг ООО [Электронный ресурс]. – М. – Режим доступа: http://www.a-filter.ru/ultrafiltracia_vody, свободный.

2. Гидра Фильтр [Электронный ресурс]. – М. – Режим доступа: http://www.water.ru/catalog/ultrafiltracija.shtml, свободный.

3. Государственная фармакопея  РФ, двенадцатое издание. Часть 1. /«Издательство  «Научный центр экспертизы средств  медицинского применения», 2008. – 704 с.:ил.

4. Современные решения  для биотехнологий: каталог продукции: - Владимир: ЗАО «Владисарт», 2013. – 146 с.

5. Медицинский бизнес  – издательский дом [Электронный ресурс]. /Статьи фармацевтические технологии и упаковка – лекарства по GMP. – М. – Режим доступа: http://www.medbusiness.ru/217.php, свободный.

6. Национальный фармацевтический  университет, кафедра заводской  технологии лекарств [Электронный ресурс]. – Харьков, [2010 - ]. – Режим доступа: http://ztl.nuph.edu.ua/html/medication/chapter19_07.html, свободный.

7. НПК «Медиана-фильтр»  [Электронный ресурс]. – М., [2011 - ]. – Режим доступа: http://ecell.ru/khor16.html, свободный.

8. Патофизиология. В 3 т.: учеб. для студ. высш. учеб. заведений/ [А.И. Воложин и др.]: под ред. А.И. Воложина, Г.В. Порядина. –Т.1. – М.: Издательский центр «Академия», 2006. – 272 с.

9. Патофизиология : учебник : в 2 т. / под ред. В.В. Новицкого, Е.Д. Гольдберга, О.И. Уразовой. - 4-е изд., перераб. и доп. - ГЭОТАР-Медиа, 2009. - Т. 1. - 848 с. : ил. 

10. СЕПТЕХ® [Электронный ресурс]. – Новосибирск, [2006 - ]. – Режим доступа:http://www.septech.ru/index.php?action=topics&menu_id=287&page_id=286, свободный.

11. ТКП/РП 1 – 2013. Производство  лекарственных средств. ПРОЦЕССЫ  СТЕРИЛИЗАЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ  СУХОГО ЖАРА. – Минск: Департамент  фармацевтической промышленности  Министерства здравоохранения Республики  Беларусь, 2013. – 21 с.

12. Ультрафильтрация. Руководство по эксплуатации. – М.: ООО «Kaufmann Technology», 2013. – 73 с.

13. European Pharmacopoeia 6.0 2.6.8 Pyrogens. – Strasbourg, Council of Europe, 2008.

14. European Pharmacopoeia 6.0 2.6.14 Bacterial endotoxins. – Strasbourg, Council of  Europe, 2008.