Строение, свойства и биологическая роль биотина и тиамина

  

 

Исследование   биосинтеза биотина в растениях   (В. Филиппов, 1962 г .) показало, то каждый орган растения и каждая его клетка синтезирует витамин в эмбриональной фазе своего развития. В дальнейшем синтез замедляется и, по-видимому, прекращается, но содержание его различных тканях долгое время остается постоянном.  

 

Обмен биотина  в организме 

Об обмене биотина известно немного. Биотин, поступивший с пищей в связанном состоянии, отщепляется от белка под действием протеолитических ферментов, переходит в водорастворимую форму и всасывается в кровь в тонком кишечнике. В кишечнике происходит также всасывание биотина, синтезированного бактериями желудочно-кишечного тракта. Всосавшийся в кровь биотин связывается с альбумином сыворотки разносится по всему организму. Наибольшее количество биотина накапливается в печени, почках и надпочечниках, причем у мужчин оно несколько больше, чем у женщин.  

 

Содержание биотина  в тканях человека (Р. Д. Вильяме, 1950)

Органы и ткани	Биотин в мкг/г
	у женщин	у мужчин
Кожа	—	0 01
Мозг	0,03	0,08
Легкие	0,02	0,01
Сердце	0,17	0,19
Мышцы	0,02	0,04
Желудок	0,19	0,11
Ободочная кишка	0,08	0,09
Печень	0,62	0,77
Молочная железа	0,04	—
Селезенка	0,04	0.06
Почки	0 58	0,67
Надпочечники	0,35	0,23
Семенники	—	0,05
Яичники	0,03	——

 

  

Что касается содержания биотина в  крови человека, то по этому вопросу имеется ограниченная и порой противоречивая информация. Bhagavan и Coursin в 1967 г . определили содержание биотина микробиологическим методом в крови 30 здоровых лошадей и 25 взрослых людей и показали, что в среднем в крови взрослых людей содержится 25,7 ммкг% биотина (12—42,6 ммкг%), а в крови детей несколько больше—32,3 ммкг% (14,7—55,5 ммкг%). По данным Baugh (1968), средний уровень биотина в цельной крови составляет 147 ммкг% (82— 270 ммкг%). Какой-либо разницы, в содержании биотина в .крови в зависимости от пола и возраста не отмечено. Содержание биотина в молоке женщины резко изменяется в период кормления. В первый день после родов содержание биотина b молоке невелико и только на 10-й день повышается до 0,33 мкг на 100 мл.

Биотин почти не подвергается Обмену в организме человека и выводится в неизмененном виде в основном с мочой. У здоровых людей выведение биотина с мочой составляет 11—183 мкг в сутки, у новорожденных детей достигает максимума (4 мкг на 100 мл)_ на 2-й день жизни и снижается до нуля к 7-му дню. Содержание биотина в кале колеблется   от 322 до 393 mкг   в сутки. В норме выделение биотина с мочой и калом повышает поступление его с пище 3-6 раз. что свидетельствует о удовлетворении потребностей человека в биотине на счет бактериального синтеза в кишечнике. Через 6 часов   после введения человеку массированной дозы биотина большая часть его выводится с мочой. Содержание биотина в кале при этих же условиях изменяется в меньшей степени.

Небольшая часть карбоксильной  группы боковой цепи биотина окисляется до СО ₂ специфической оксидазой, которая обнаружена в печени и почках морской свинки и крысы.

Исследование распределения меченого биотина в тканях цыплят и крыс показало, что уже через 4 часа после  выведения физиологической дозы меченного С ¹ ' по карбоксильной группе биотина около 16% метки включалось в печень, а 30% выводилось с калом и мочой в неизмененном виде (Dakshinamurty, Mistry, 1963). В сердце, селезенке и легких радиоактивности не обнаружено. Менее 4% введенной дозы выводилось в виде выдыхаемого C ¹⁴ O ² , что указывало на незначительное прямое окисление карбоксильной группы биотина. О распределении меченого биотина в различных клеточных фракциям можно судить по табл.  

 

Содержание биотина в клеточных  фракциях печени нормальных крыс (Dakshinamurti, Misfry, 1963)

Фракция печени	Нормальные животные		Авитаминозные животные
	Общий биотин в %	Связанный биотин в % к общему	Общий биотин (в %)
Гомогенат	100	92	100
Ядра	37	99	75
Митохондрии	9	89	13
Микросомы	2	23	о
Надосадочная жидкость	47	91	о

 

  

Из таблицы видно, что 40—50% радиоактивности  обнаружено в надосадочной фракции, полученной после центрифугирования  гомогената печени крыс. В микросомах содержится незначительное количество витамина. Большая часть биотина в различных клеточных фракциях, за исключением микросом, присутствует в связанной с белком форме. Имеются и противоречивые данные о том, что большая часть биотина (более 60%) содержится в митохондриях печени животных и около 11%— в микросомах.

В настоящее время недостаточно исследована динамика содержания биотина  в тканях в онтогенезе животных. По-видимому, яйцо и зародыш в  начальной стадии развития наиболее богаты биотином. Развитие зародыша сопровождается снижением содержания биотина в тканях. Исключение составляют печень и почки, в которых содержание биотина значительно повышается в первые дни постэмбрионального развития.  

 

Участие биотина в  обмене веществ и механизм действия

К 1958—1959 гг . накопились данные, которые  указывали на участие биотина в реакциях карбоксилирования. Установлено, что при биотиновой недостаточности нарушаются следующие функции печени животных:

синтез цитруллина из орнитина, МН ₃ и С0 ₂ , включение CО ₂ в пурины, карбоксилирование пропионовой кислоты, приводящее к образованию янтарной кислоты, включение С0 ₂ в ацетоуксусную кислоту. Однако механизм действия биотина в этих реакциях оставался невыясненным. Данные опытов с 2-C ¹⁴ -биoтинoм исключали возможность того, что С-атом уреидной группировки биотина переносится в качестве остатка угольной кислоты. Одним из обстоятельств, из-за которых подвергалась сомнению функция этого витамина как кофермента карбоксилирования, было (описанное в разное время) участие биотина в реакциях, в которых не происходило ни включения, ни отщепления С0 ₂ . Так, было обнаружено влияние биотина на дезаминирование аспарагиновой кислоты, серина и треонина и участие его в синтезе жирных кислот. Первые четкие доказательства коферментной функции биотина в реакции карбоксилирования появились в работах, посвященных именно синтезу жирных кислот. В этих работах отмечалось, что биотин является коферментом ацетил-КоА-карбоксилазы, фермента, осуществляющего карбоксилирование ацетил-КоА с образованием малонил-КоА—первую стадию синтеза жирных кислот (Wakil, 1958). К этому времени были получены доказательства существования еще одного биотинфермента, а именно (З-метил-кротонил-КоА-карбоксилазы (Lynen, Knappe, 1959). Все известные в настоящее время биотиновые ферменты катализируют два типа реакций:

Реакции карбоксилирования или  фиксации С0 ₂ , сопряженные с расщеплением АТФ и протекающие согласно уравнению:  

 

АТФ + НСОз + RH R—СОО ^- + АДФ + Фнеорг.  

 

 

 

 

 

Реакции	Источник фермента
Ацетил-КоА + С0 2 + АТФ Малонил-КоА + АДФ + Ф Я-Метилкротонил-КоА + С0 2 + АТФ Я -Метилглютаконил-КоА+ АДФ + Ф  Пропионил-КоА + С0 2 + АТФ Метилмалонил-КоА + АДФ + Ф     Бутирил-КоА+С0 2 + АТФ Этилмалонил-КоА+АДФ+ Ф     Пируват + С0 2 + АТФ Щавелевоуксусная кислота	Печень голубя     Микробактерии     Сердце и печень свиньи Мышцы и печень                            голубя Печень голубя

 

  

II. Реакции транскарбоксилирования, протекающие без распада АТФ,  при которых карбоксилирование  одного субстрата осуществляется  при одновременно протекающем  декарбоксилировании другого соединения:

R ₁ —COO ^- + R ₂ H R ₁ H + R ₂ — COO ^-

Поскольку все приведенные реакции  являются обратимыми, возможен обратимый биосинтез АТФ. Во всех этих случаях имеет место включение С02 в реактивное α-подожение ацил-КоА или винилгомологичное ему положение (при карбо^силировании β-метилкротонил-КоА).

К началу 60-х год5В были выделены и изучены карбоксилазы, осуществляющие указанные превращения —В 1960 г . установлено участие биотина в реакции транскарбоксилирования при исследовании синтеза пропионовои кислоты  

 СНз—СН—СО~ S —КоА + СНз—СО—СООН 

 

 

СООН  

  

 СНз-СНа—СО~ S -КоА + НООС-СН  ₂ —СО—СООН

Биотиновые ферменты представляют собой олигомеры с большим  молекулярным весом (порядка 700000) и, как правило, содержат 4 моля связанного биотина на 1 моль фермента, поэтому кажется вероятным, что они состоят из 4 субъединиц с молекулярным весом 175000, каждая из которых содержит одну молекулу биотина.

В работах Lynen (1964) расшифрован механизм участия биотина в реакциях карбексилирования. Установлено, что реакции карбоксилирования являются двухстадийными. Первая стадия сводится к образованию «активной С0 ₂ » в форме С0 ₂ ~биотинфермента:

АТФ + Н С0 ^- ₂ + биотинфермент АДФ + Фнеорг. + С0 ₂ ~биотинфермент.

Вторая  стадия заключается в переносе «активной С0 ₂ » на акцептор:

С0 ₂ ~биотинфермент + R ₂ H биотинфермент + R ₂ — С00 ^-

Аналогичный двух стадийный механизм предложен  и для реакций транскарбоксилирования:

R ₁ —С00 ^- + биотинфермент С0 ₂ ~биотинфермент R ₂ H;

С0 ₂ ~биотинфермент + R ₂ H R ₂ — С00 ^- + биотинфермент.

После установления существования «активной  С0 ₂ » в виде С0 ₂ ~биотинфермента установлен характер связи между С0 ₂ и биотином. Этому способствовало открытие того факта, что β-метилкротонил-КоА-карбоксилаза способна карбоксилировать свободный биотин, переводя его в карбоксибиотин. В дальнейшем меченый карбоксибиотип был выделен в опытах с С ¹⁴ -бикарбонатом и идентифицирован как Г-М-карбоксибиотин. Его структура была подтверждена химическим синтезом. К атому времени уже было известно, что в биотиновых ферментах карбоксильная группа биотина соединена с ε- NH ₂ -группой лизина ферментного белка ковалентной связью. На основании этих данных предложена структура С0 ₂ ~биотинфермента.  

   

 

Эта структура получила ряд экспериментальных подтверждений и в настоящее время является общепринятой для всех биотиновых ферментов. Реакционная способность углекислоты, связанной с биотином, находит выражение в энергетических взаимоотношениях. Величина свободной энергии распада С0 ₂ ~биотинфермента равна 4,74 ккал/моль, что дает основание причислить С0 ₂ ~биотинфермента к «богатым энергией» соединениям.

Исключительно большой интерес представляет совершенно неизученная проблема регуляции активности биотинсодержащих ферментов и организме. В этой связи особенно важны исследования по биосинтезу молекулы биотина и образованию холоферментов из биотина и соответствующего ферментного белка. Данные по первому вопросу изложены в разделе «Биосинтез». Что касается образования холофермента, то можно считать установленным, что во всех биотиновых ферментах био-тнн связан с ε-аминогруппой лизина. Этот способ связи экспериментально доказан почти для всех карбоксилаз и метилмалонил-КоА-оксалоаце-таттранскарбоксилазы. Недостаточные по биотину клетки Propionibacterium s h c e manii содержат апофермент и специфическую синтетазу, которая катализирует при использовании АТФ соединение биотина с апоферментом, приводящее к образованию активного холофермента траискарбокснлазы. Необходимыми кофакторами этой реакции являются АТФ и Mg ²⁺ . При использовании очищенных ферментов удалось доказать, что образование холотранскарбоксилазы происходит в два этапа, причем промежуточным соединением является биотиниладенилат (R-CO-5'-AMФ):

Mg2+

I. АТФ + R— С0 ₂ Н + синтетаза R -СО-5’- АМФ - синтетаза + пирофосфат

(биотин 

II. R -СО-5’- АМФ - синтетаза + Н  ₂ М-фермент          R-CO-NH-фермент +

+5’-AMФ+cинтeтaзa.

Синтетический биотиниладенилат обладает способностью заменить смесь АТФ, MgCl и биотина  при синтезе холофермента (Lynen, 1964). Позже было установлено, что образование других холоферментов протекает аналогичным образом. Все известные ферментативные реакции, для которых установлено участие биотина в качестве кофермента, являются процессами переноса углекислоты. По-видимому, в обратимом присоединении и отдаче СО; и состоит исключительная функция этого витамина в обмене веществ. Однако при биотиновой недостаточности нарушаются очень многие реакции обмена в интактном организме. Так, - биотин вовлечен в биосинтез белков, дезаминирование аспартата, серина и треонина у бактерий, обмен триптофана, жиров и углеводов, синтез пуринов, образование мочевины у животных и др. Природа участия биотина во многих из этих реакций остается неясной. Все перечисленные процессы имеют одну общую черту: при изучении in vitro они не тормозятся авидином. На основании этих данных считается, что биотин оказывает непрямое действие на указанные превращения, которые катализируются ферментами, не содержащими этого витамина.