Технология получения интерферона

8.3 Розлив и  лиофильная сушка. В ампулы и флаконы емкостью 5-10 мл препарат разливают по 2 мл. Во флаконы емкостью 500 мл по 50 мл.

Препарат вводят мерно  с помощью дозатора или бюретки  со строгим соблюдением условий  стерильности. Ампулы или флаконы  с препаратом перекрывают стерильными  марлевыми (2 слоя) тампонами и устанавливают вертикально в кассеты сушильного аппарата. Кассеты с препаратом подвергают замораживанию при 36-40°С в течение 48-72 часов. Лиофилизацию проводят в вакуумсушильных аппаратах любой системы.

Препарат хранят в  сухом, защищенном от света месте при температуре от +4 до 10°С. Срок годности препарата 1,5 года с момента изготовления.

Низкий выход продукта, высокая стоимость сырья и  ограниченность его источников определяют высокую стоимость препарата, получаемого технологией лейкоцитарного интерферона, и накладывают ограничения на возможность его производства в количествах, необходимых для медицины и научных исследований. Поэтому в течение последних 15 лет в ведущих странах мира проводятся исследования по получению человеческого лейкоцитарного интерферона микробиологическим синтезом с использованием рекомбинантных штаммов-продуцентов.

2.2 Технология получения интерферона генно-инженерным методом

В настоящее время  более перспективным признан  способ получения интерферона микробиологическим синтезом, который обеспечивает возможность получения целевого продукта со значительно более высоким выходом из сравнительно недорогого исходного сырья. Используемые при этом подходы позволяют создать оптимальные для бактериальной экспрессии варианты структурного гена, а также регуляторных элементов, контролирующих его экспрессию.

В качестве исходных микроорганизмов  используют различные конструкции  штаммов Pichia pastoris, Pseudomonas putida и Escherichia coli.

Недостатком использования P. pastoris в качестве продуцента интерферона, является крайне сложные условия ферментации этого типа дрожжей, необходимость строго поддерживать концентрацию индуктора, в частности метанола, в процессе биосинтеза.

Недостатком использования  штаммов Ps. putida является сложность процесса ферментации при низком уровне экспрессии (10 мг интерферона на 1 л культуральной среды). Более продуктивным является использование штаммов Escherichia coli.

Но не смотря на все  недостатки данных методов, были созданы  и используются для получения интерферона большое количество плазмид и созданных на их основе штаммов Е. coli, экспрессирующих интерферон: штаммы Е. coli ATCC 31633 и 31644 с плазмидами Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 или Z-pBR 322(Pstl)/HclN SN 35-AHL6 (SU 1764515), штамм Е. coli pINF- AP2 (SU 1312961), штамм Е. coli pINF- F-Pa (AU 1312962), штамм E.сoli SG 20050 с плазмидой p280/21FN [4], штамм E.сoli SG 20050 с плазмидой pINF14 (SU 1703691), штамм E.coli SG 20050 с плазмидой pINF16 (RU 2054041) и др. Недостатком технологий, основанных на использовании этих штаммов, является их нестабильность, а также недостаточный уровень экспрессии интерферона.

Обработанный нами обзор  литературы показывает, что на данный момент в мире создано большое  количество гибридных штаммов, продуцирующих  в качестве продукта интерферон. Каждый из этих штаммов был создан на основе технологии рекомбинантных ДНК по общепринятой методике (рисунок 4).

Из клетки человека изолирован ген, ответственный за биосинтез  ИФН. Экзогенный человеческий ИФН получают, используя технологию рекомбинантных ДНК. Процедура выделения кДНК ИФН-ов состоит в следующем:

1) Из лейкоцитов человека  выделяют мРНК, фракционируют ее  по размерам, проводят обратную  транскрипцию, встраивают в сайт модифицированной плазмиды.

2) Полученным продуктом  трансформируют Е. соli; образовавшиеся клоны подразделяют на группы, которые идентифицируют.

3) Каждую группу клонов  гибридизируют с ИФН - мРНК.

4) Из образовавшихся  гибридов, содержащих кДНК и хРНК, выделяют мРНК, проводят ее трансляцию  в системе синтеза белка.

5) Определяют интерферонную  противовирусную активность каждой  смеси, полученной в результате  трансляции. Группы, проявившие интерферонную  активность, содержат клон с кДНК, гибридизировавшийся с ИФН - мРНК; повторно идентифицируют клон, содержащий полноразмерную ИФН - кДНК человека.

Рисунок 4 –Схема технологии рекомбинантных ДНК, используемая для получения гибридных клеток, продуцентов интерферона

          Но дальнейшее культивирование полученных штаммов и очистка готового продукта имеет свои особенности, представленные на нижеприведенных примерах.

Наряду с особенностями  используемых штаммов эффективность  процесса во многом зависит от используемой технологии выделения и очистки интерферона.

Перспективным подходом для получения бета-интерферона  человека в значительных количествах является использование микроорганизмов в качестве продуцентов этого препарата. Существует ряд штаммов Escherichia coli, продуцирующих бета-интерферон человека. Уровень продукции колеблется от 1.5 до 6000 млн. ед. биологически активного бета-интерферона на литр культуры и составляет в определенных случаях несколько десятков миллиграммов [5]. Содержание его в клетках может достигать около 2% суммарного клеточного белка.

Известен также способ получения интерферона, включающий в себя культивирование штамма E.coli SG 20050/pIF16, в LB-бульоне в колбах в термостатированном шейкере, центрифугирование биомассы, ее промывку буферным раствором и обработку ультразвуком для разрушения клеток. Полученный лизат центрифугируют, промывают 3М раствором мочевины в буфере, растворяют в растворе гуанидин хлорида в буфере, обрабатывают ультразвуком, центрифугируют, проводят окислительный сульфитолиз, диализ против 8 М мочевины, ренатурацию и окончательную двухстадийную хроматографию на СМ-52 целлюлозе и сефадексе G-50 [6]. Недостатками этого способа является его относительно невысокая производительность основных этапов процесса выделения и очистки. В особенности это относится к ультразвуковой обработке продукта, диализу и окислительному сульфитолизу, что приводит к нестабильности выхода интерферона, а также к невозможности использования этого метода для промышленного производства интерферона.

По используемой питательной  среде, условиям культивирования, принципу конструирования плазмиды и достигаемому результату штамм E.coli SG20050/plF14 наиболее близок к штамму E.coli SG20050/plF16. Преимуществом штамма-продуцента E.coli SG20050/plF16 является более высокий уровень биосинтеза интерферона, который достигает 3-5×10⁷ ME/мл клеточной суспензии, что составляет более 50 % суммарного белка бактерий. Штамм разработан Всесоюзным научно-исследовательским институтом молекулярной биологии НПО "Вектор" (ГНЦ ВБ «Вектор») и является объектом защиты по патенту РФ N 2054041 [7].

Также известен способ получения альфа-интерферона с использованием рекомбинантного штамма Escherichia coli 294/pLelFA (ATCC 31446) с плазмидой, содержащей структурный ген человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа A (патент США N 4656131) [8]. Способ заключается в том, что в 5-литровом ферментере выращивают биомассу E.coli 294 на химически определенной среде. Используют стандартную среду М-9, обогащенную добавлением глюкозы, L-глутамата натрия, хлорида железа шестиводного, сульфата меди пятиводного, сульфата цинка, витамина B1, тетрациклина гидрохлорида, L-пролина и L-лейцина. Культивирование ведут при перемешивании 1000 об/мин, аэрации 1 л/л питательной среды в мин и при температуре 37^oC, в ходе процесса температуру ступенчато понижают до 25^oC в зависимости от оптической плотности культуральной жидкости. В течение культивирования добавляют глюкозу по мере ее потребления до исходного уровня 25 г/л, что обеспечивает уровень биосинтеза интерферона около 3,2×10⁷ ед. активности на мл культуральной жидкости.

Недостатками известного способа являются: описанная технология получения интерферона-альфа A человека микробиологическим синтезом осуществлена на лабораторном оборудовании; прямой перенос результатов от лабораторной установки к промышленному аппарату неочевиден, так как методы теории подобия, позволяющие получать критерии масштабирования, в биотехнологии, так же как и в химической технологии, непригодны [9]; при выращивании используют многокомпонентную дорогостоящую питательную среду, содержащую очищенные аминокислоты и витамин B1; для достижения высокого выхода целевого продукта используют дробное многократное добавление раствора глюкозы, что усложняет технологический процесс; используемый штамм недоступен российским производителям.

В качестве наиболее близкого аналога (прототипа) может быть указан способ получения лейкоцитарного интерферона человека, заключающийся в культивировании рекомбинантного штамма E.coli, замораживании полученной биомассы при температуре не выше -70°С, размораживании, разрушении клеток микроорганизма лизоцимом, удалении ДНК и РНК введением в лизат ДНК-азы и очисткой выделенной нерастворимой формы интерферона отмывкой буферным раствором с детергентами, растворении осадка интерферона в растворе гуанидин гидрохлорида, ренатурации и одностадийной очистке ионообменной хроматографией. В качестве продуцента используют штамм E.coli SS5, полученный с помощью рекомбинантной плазмиды pSS5, содержащей три промотора: Plac, Pt7 и Ptrp, и ген альфа -интерферона с введенными нуклеотидными заменами. Экспрессия интерферона штаммом E.coli SS5, содержащим эту плазмиду, контролируется тремя промоторами: Plac, Pt7 и Ptrp. Уровень экспрессии интерферона составляет около 800 мг на 1 л клеточной суспензии.

Недостатком способа  является низкая технологичность использования  ферментативного разрушения клеток, ДНК и РНК микроорганизма и одностадийная хроматографическая очистка интерферона. Это обуславливает нестабильность процесса выделения интерферона, приводит к снижению его качества и ограничивает возможность использования приведенной схемы для промышленного производства интерферона. А недостатками данной плазмиды и штамма на ее основе являются использование в плазмиде сильного нерегулируемого промотора фага Т7 в штамме Е. coli BL21 (DE3), в котором ген Т7 РНК полимеразы находится под промотором lac оперона и который всегда «течет». Следовательно, в клетке непрерывно происходит синтез интерферона, что приводит к диссоциации плазмиды и снижению жизнеспособности клеток штамма, и в результате - снижение выхода интерферона.

Но Escherichia coli являются условно патогенными для человека, и препараты бета-интерферона, полученные из бактериальных клеток, могут содержать эндотоксины. Полное освобождение бета-интерферона от примеси эндотоксинов, являющееся обязательным условием применения его в клинической практике, значительно затрудняет процедуру очистки рекомбинантного белка. В настоящее время зарегистрирован и разрешен к применению только один препарат рекомбинантного бета-интерферона человека, экспрессированного в Escherichia coli, производимый фирмой «Шеринг». Длительное применение его может приводить к нежелательным побочным эффектам, обусловленным условной патогенностью штамма-продуцента [10].

Все вышеизложенное свидетельствует  о перспективности создания штаммов-продуцентов  бета-интерферона человека на основе других микроорганизмов, в частности дрожжей. Применение непатогенных микроорганизмов (дрожжей), не содержащих токсических и пирогенных факторов, в качестве продуцентов белков человека позволяет использовать рекомбинантные белки в клинической практике. Однако созданные ранее в лаборатории биохимической генетики БиНИИ СПбГУ штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae - внутриклеточные и секреторные продуценты фибробластного интерферона человека - отличались низкой продуктивностью. Уровень продукции составлял от 100 мкг до 1 мг биологически активного бета-интерферона на литр культуры [11]. Кроме того, углеводный компонент белков, экскретируемых дрожжами-сахаромицетами, существенно отличается от такового гликопротеинов высших эукариота [12]. Углеводная часть гликопротеинов является сильной антигенной детерминантой, поэтому рекомбинантный бета-интерферон человека, секретируемый дрожжами Saccharomyces cerevisiae, может применяться только для лабораторных исследований [13].

Использование для гетерологичной экспрессии метилотрофных дрожжей Pichia pastoris представляет особый интерес. Это, во-первых, дает возможность существенно повысить выход рекомбинантных белков. Во-вторых, гликопротеины, секретируемые дрожжами Pichia pastoris, не содержат маннозных остатков, связанных α1-3 связями и являющихся сильными антигенными детерминантами, что позволяет получать наряду с внутриклеточными аутентичные секреторные формы рекомбинантных белков [14]. Получение секреторного продуцента бета-интерферона человека особенно актуально. Белок является гликопротеином, и только в процессе секреции он претерпевает гликозилирование и приобретает правильную конформацию. Накопление рекомбинантного белка в культуральной жидкости значительно упрощает процедуру его очистки.

Известен способ получения интерферона, включающий в себя культивирование клеток Ps. putida, разрушение биомассы, обработку полиэтиленимином, фракционирование сернокислым аммонием, гидрофобную хроматографию на фенилсилохроме С-80, рН-фракционирование лизата, его концентрирование и диафильтрацию, ионообменную хроматографию на целлюлозе DE-52, элюирование в градиенте рН, ионообменную хроматографию полученного элюента на целлюлозе СМ-52, концентрирование пропусканием через кассету фильтров и гель-фильтрацию на Сефадексе G-100 (SU 1640996). Недостатком этого способа кроме сложной многостадийной ферментации является многостадийность при получении конечного продукта.

В литературе описывается способ получения интерферона-альфа-2 с использованием рекомбинантного штамма Pseudomonas sp. VG-84 в ферментере с рабочим объемом 10 л. Способ заключается в том, что рекомбинантные бактерии Pseudomonas species культивируют на питательной среде, содержащей гидролизат пекарских дрожжей, D-глюкозу, сернокислый аммоний, фосфорнокислый однозамещенный калий, хлористый натрий, сернокислый семиводный магний и хлористый кальций при температуре 30±0,5^oC, pH 7,0±0,1. Каждые полчаса измеряют оптическую плотность культуральной жидкости и определяют скорость роста бактерий, с ростом величины оптической плотности увеличивают парциальное давление кислорода от 40% от насыщения при 2,5-3,0 опт. ед. до 70% от насыщения при 6,5-7,0 опт. ед. и через 15-30 мин после достижения бактериями максимальной скорости роста температуру среды понижают от 30±0,5^oC до 20±0,5^oC. Процесс завершают через 2,5±0,5 ч после снижения температуры, что позволяет стабилизировать и повысить выход альфа-2-интерферона. Необходимое парциальное давление кислорода поддерживают, меняя расход воздуха, водородный показатель регулируют подачей либо 40%-ного раствора гидроокиси натрия, либо 35%-ного раствора фосфорной кислоты. Достигаемая продуктивность по альфа-2-интерферону составляет 2,6×10⁶ МЕ/мл культуральной жидкости.

Недостатками известного способа являются: необходимость  в тщательном контроле и регулировании условий культивирования: температуры, pH, парциального давления кислорода, оптической плотности среды; выход целевого белка составляет не более 2,6×10⁶ МЕ/мл культуральной жидкости, что на порядок ниже выхода, достигаемого при культивировании E.coli SG 20050/plF16 на лабораторном оборудовании; при культивировании на одном и том же промышленном оборудовании выход целевого белка также на порядок ниже выхода достигаемого при культивировании E.coli SG 20050/plF16; более высокая по сравнению с культивированием E.coli SG20050 plF/16 стоимость питательной среды; более высокие энергетические затраты, необходимые для интенсивной аэрации и интенсивного перемешивания культуральной жидкости.