Получение пребиотической производной лактозы - лактулозы

Известны разработки, предусматривающие  совместное использование щелочей и сульфитов. Так, например, в качестве катализаторов применяют гидроксид натрия и сульфит натрия, которые вносят в количестве 0,3 и 1% соответственно в 60%–ные растворы лактозы и термостатируют их при 75–80 "С в течение 15 мин. Степень конверсии лактозы в лактулозу составляет при этом около 30%, а при использовании в качестве катализатора сульфида натрия в дозе 0,7% доходит до 40%. В патенте США в качестве катализаторов

используют гидроксид  магния и гидросульфит натрия, которые добавляют к 60–70%–ному раствору лактозы в количестве 0,05–0,2%. Изомеризацию лактозы в лактулозу проводят при температуре 90–100 °С. Сульфит щелочных металлов используется в качестве восстановителя и в патенте [187].

К этой же группе способов могут  быть отнесены разработки, предусматривающие использование в качестве реагентов солей слабых кислот (например, карбонатов или ортофосфатов), или слабых кислот (например, угольной или ортофосфорной), при этом уровень рН доводят до 7,5–14 сильным основанием [71]. Частным случаем является использование карбоната гуанидина в количестве 0,1–9,2% от массы взятой лактозы [70].

Таким образом, свойства применяемых  катализаторов определяют особенности этой группы способов получения лактулозы:

– использование концентрированных, пересыщенных растворов лактозы, благодаря чему часть непрореагировавшей лактозы выделяется после охлаждения без предварительного сгущения;

–проведение процесса изомеризации при повышенных температурах;

 –применение затравки лактозы для ускорения процесса кристаллизации.

3.Изомеризация высокоэффективным комплексным катализатором.   Использование высокоэффективных катализаторов в виде боратов, по всей вероятности, так–же приводит к образованию боратных комплексов. Последние значительно снижают энергию активации реакции изомеризации, изменяют конфигурацию углевода таким образом, что образование кетозы становится конформационно и энергетически выгодным.    Рассмотрим возможный механизм реакции изомеризации лактозы в лактулозу в щелочных средах с использованием боратов.    Наиболее «кислой» в моно– и дисахаридах является так называемая «аномерная» ОН–группа. Эта группа по преимуществу участвует в комплексообразовании наряду с соседней ОН–группой, что подтверждено методом ЯМР В11 [328]. В последнее время установлено, что не только фуранозные формы моноз могут образовывать боратные комплексы. Ациклические формы также взаимодействуют с борат–ионами, если имеют син–1,2 или син–1,3 ОН–группы[272]. При комплексообразовании вицинальных ОН–групп с тетраэдрическим [В(ОН)4]~ –анионом наиболее благоприятными конформациями являются:

–син–перипланарная (цмс–конформация) с расстоянием между О– О в пределах 2,5 А и углом между связями С–ОН а = ±30°;

– син–клинальная, у которой в пиранозном кольце вицинальные группы ориентированы аксиально–экваториально [287].

Известно, что расстояние между атомами кислорода О–О для тетрагонального бора (в ионе [В(ОН)4]~) равно 2,40–2,67 А. Таким образом, тетрагидроксоборат–ион будет образовывать комплексы с теми полигидроксисоединениями, в которых по меньшей мере две гидроксильные группы отделены друг от друга или могут быть легко приближены друг к другу ьна расстояние приблизительно 2,4 А.

Анализ расстояний между  атомами кислорода при С1 и С2 в молекуле а–лактозы показывает, что расстояние между ними составляет 2,50 А. Эффективный отрицательный заряд на атоме кислорода при С1 также является наибольшим. Следовательно, наиболее вероятно образование боратного комплекса при взаимодействии тетраборат–иона с гидроксильными

группами при С1 и С2.

Известно, что комплексообразование обнаруживается по изменению оптического вращения. Оптическое вращение сильно меняется только тогда, когда комплекс образуется при двугранном угле между ОН–группами около 60. В этом случае комплексообразование деформирует цикл, что и приводит к изменению оптического вращения. Исходная величина двугранного угла в молекуле а–лактозы между ОН–группами при С1 и С2 составляет– 9,1 (по данным HyperChem 7.01). В результате протекания процесса комплексообразования двугранный (торсионный) угол 0 2 – С 2– С 1– 0 1 изменяется и после оптимизации геометрии полученного комплекса с использованием полуэмпирического метода становится равным 8,63 что свидетельствует об изменении конформации пиранозного цикла глюкозы.

Для изучения закономерностей  процесса взаимодействия лактозы с  тетрагидроксоборат–ионом в СевКавГТУ [259] был проведен ряд опытов, в которых измерялся удельный угол вращения поляризованного света раствором лактозы в зависимости от мольной доли добавленного тетрабората калия. Известно [352], что тетраборат калия в водном растворе эквивалентен эквимолярным количествам бората калия и борной кислоты, т. е.в связи с тем что в кислых средах образование боратных комплексов при взаимодействии

углеводов с борной кислотой происходит в очень небольшой  степени и обнаружить их методом поляриметрии практически невозможно, присутствием борной кислоты в кислых средах можно пренебречь. В этом случае 1 моль тетрабората можно считать эквивалентным 2 молям борат–иона или борной кислоты, которая в щелочных средах при взаимодействии с водой образует реакционноспособный тетрагидроксоборат-ион.

Следовательно, в щелочных средах равновесие данной реакции смещено в сторону образования тетрагидроксоборат-иона, который и вступает в реакцию комплексообразования с диольными группами углеводов.

Учитывая соотношения  тетрабората калия и тетрагидроксоборат-иона, можно сделать предположение, что наибольшие изменения конформации лактозы наблюдаются при эквимолярном соотношении, а также при соотношении, когда на 2 молекулы лактозы приходится один тетрагидроксоборат-ион.               Видимо нельзя исключать возможности образования надмолекулярного комплекса, который разрушается при увеличении содержания тетрагидроксоборат–иона в растворе с образованием устойчивого циклического комплекса тетрагидроксоборат–лактоза.        В дальнейшем, при повышении температуры и увеличении концентрации гидроксид-ионов, происходит нуклеофильная атака гидроксид–иона, направленная на атом водорода при а–углеродном атоме, т. е. при С2.

В результате этого протекает  реакция элиминирования по механизму  Е2 и образуется ендиол в виде комплекса с тетрагидроксоборат-ионом .

Данное явление связано  с тем, что энергия активации  реакций элиминирования выше, чем реакций замещения. Поэтому при повышении температуры элиминирование преобладает над замещением независимо от того, имеет ли реакция первый или второй порядок .

Известно, что боратно–углеводные соединения разрушаются при добавлении кислоты с освобождением сахара и образованием соли борной кислоты . Поэтому подкисление системы приводит к разрушению комплекса тетрагидроксоборат–ендиол, образованию борной кислоты и ендиола. Образовавшийся ендиол изомеризуется в наиболее устойчивую кетонную форму, т. е. в лактулозу в ациклической форме. В результате таутомерных превра-

щений образуется равновесная  система, содержащая 50% р–пиранозной, 40% р–фуранозной и 10% а–фуранозной форм лактулозы, что было доказано в результате обработки спектров ЯМР (одномерного и двумерного С05У-спектра), полученных в ИНЭОС АН.        Все три формы лактулозы находятся в термодинамическом равновесии и их относительное содержание зависит от внешних условий (среда, температура и т. д.).

В работе [350] было изучено  соотношение стереоизомерных форм лактулозы в водном

растворе после заморозки  и последующей сублимационной сушки. Было найдено следующее соотношение  таутомерных форм – p–пираноза : Р–фураноза : а–фураноза = 65 : 24 : 10.

Некоторое отличие можно  объяснить условиями анализа, тем  более что в работе [384] указывалось на значительное влияние температуры на соотношение таутомерных форм лактулозы. Этими авторами было показано, что при 73 °С в равновесном водном растворе лактулозы содержится 52,1% р–пиранозной, 35,5% Р–фуранозной и 12,4% а–фуранозной форм лактулозы, полученные данные хорошо коррелируют с данными, полученными в СевКавГТУ [259].

Ранее было показано [240], что  использование сульфита натрия в  процессе изомеризации резко уменьшает образование окрашенных продуктов реакции. Это связано с протеканием в реакционной смеси химических реакций восстановления окислителей и снижением величины окислительно–восстановительного потенциала системы. Кроме того, сульфит–ион

активно участвует в формировании промежуточных комплексов, возникающих при взаимодействии альдозы с тетрагидроксоборат-ионом и смещает равновесие реакции в сторону образования кетозы. Поэтому вполне логичным представлялось растворение молочного сахара в водном растворе сульфита натрия, тетрагидроксобората натрия и гидроксида натрия при температуре не выше 80 "С. Затем целесообразно выдерживать систему при интенсивном перемешивании до достижения постоянной величины значения угла вращения плоскости поляризации. В дальнейшем изомеризованный раствор охлаждался, подкислялся и деминерализовывался методом электродиализа и ионного обмена.           

Таким образом, на основе теоретических  изысканий и экспериментальных наблюдений предложен механизм изомеризации а–лактозы в лактулозу в присутствии высокоэффективного комплексного катализатора тетрагидроксоборат–иона и стабилизирующей добавки в виде сульфита натрия.

Глава 3. Частные производства.        Проведен анализ влияния лактулозы на органолептические, биотехнологические и микробиологические свойства кисломолочных напитков. Лактулоза вносилась в молоко на разных технологических этапах, в частности до и после пастеризации, с различной концентрацией сиропа лактулозы(1%, 2%, 3%, 4%). При этом лактулоза, введенная до пастеризации интенсифицирует процесс сквашивания, кисломолочные напитки приобретают характерный кремовый оттенок и вкус, присущий ряженке.      Полученные результаты могут быть использованы при производстве кисломолочных напитков с целью придания им аналогичных ряженке характеристик без энергоемкого процесса томления, и придания напиткам статуса продуктов функционального питания.       В настоящее время, в связи с возросшим ростом интереса к функциональным продуктам, оказывающих регулирующее действие на организм и способных заменить многие лекарственные препараты, при производстве некоторых кисломолочных продуктов используются пробиотики (биопрепараты из нормальной микрофлоры кишечника), пребиотики (вещества, способствующие адсорбции бифидо– и лактобактерий в кишечнике) или симбиотики (комплексы про– и пребиотиков), что повышает их пищевую и диетическую ценность.           Наиболее изученным бифидогенным фактором (пребиотиком) является лактулоза− продукт переработки молочной сыворотки. Вот уже полвека она используется в фармацевтике и пищевой промышленности для лечения и профилактики заболеваний желудочно-кишечного тракта.    Лактулоза обладает рядом полезных свойств:      –не расщепляется пищеварительными ферментами в верхних отделах желудочно–кишечного тракта (ЖКТ);        –в неизмененном виде достигает нижних отделов ЖКТ (толстой кишки);              –избирательно стимулирует рост и развитие защитной (полезной) микрофлоры кишечника– бифидобактерий, лактобактерий и прочие;    –подкисляет содержимое кишечника;       –выводит аммиак;          –повышает перистальтику, осмотическое давление;      –ингибирование активности ферментов, продуцирующих токсины;  –предотвращает образование желчных камней;       –сокращает время нахождения токсинов в организме;     –контролирует уровень глюкозы и инсулина;       –предотвращает желудочно-кишечные инфекции.    Пищевые продукты, обогащенные лактулозой впервые появились в Японии в 80–х годах прошлого века. Компания «Моринага Милк Ко», вот уже более 20 лет производит молочные продукты, обогащенные лактулозой. С 2000 года лактулозосодержащие пищевые продукты появились и в России. На сегодняшний день в Удмуртской Республике пока не производятся продукты с использованием бифидогенного фактора − лактулозы, хотя в целом от ее внесения технологический процесс не изменяется, а напитки, выработанные с добавлением лактулозы приобретают статус продуктов функционального питания. Таким образом, разработка технологии и оценка качества симбиотического продукта на основе кисломолочного напитка и лактулозы является актуальной.          Целью работы явилось изучение качества кисломолочных продуктов (на примере кефира и ацидофилина), полученных при добавление в молоко лактулозы.            В задачи исследований входило:      1.провести оценку качества молока-сырья;      2. изучить технологию приготовления кисломолочных продуктов с добавлением лактулозы;          3. провести оценку качества готовых продуктов:     –изучить ферментативную активность микроорганизмов закваски различных типов в отношении лактулозы при сквашивании и хранении;   –исследовать влияние лактулозы на органолептические, биотехнологические и микробиологические свойства кисломолочных напитков;   Исследовательская работа проводилась в лаборатории «Биохимия молока и мяса» ФГОУ ВПО Ижевская ГСХА на кафедре «Технология переработки продукции животноводства» по схеме, указанной на рис.1   В основные этапы исследований входило:     1. Изучить качество молока-сырья на анализаторе молока «Клевер» 1–М, где определить следующие показатели: СОМО, плотность содержание жира, белка. Кислотность определить титриметрическим методом согласно ГОСТ 3624–92.           2. Производство кисломолочных продуктов осуществляют как резервуарным, так и термостатным способами. Но, поскольку, условия лабораторные, то в нашем случае наиболее приемлем термостатный способ производства. Лактулозу вводили на разных технологических этапах, в частности до и после пастеризации.          3. Изучить влияние бифидогенного концентрата «Лактусан», введенного до и после пастеризации, на активность кислотообразования микрофлоры закваски, используя биологически активную добавку сироп лактулозы «Лактусан» производства ООО «Фелицата Холдинг» по ТУ 9229–010–53757476–03, закваски бактериальные: ацидофильная, кефирная производственные. Для определения активности закваски в процессе сквашивания каждый час контролировали титруемую кислотность (ГОСТ 3624–92) как в контрольных образцах, так и в опытных образцах кисломолочных продуктов с «Лактусаном», введенном до и после пастеризации. Сравнительную оценку результатов проводили при достижении готовности сгустка.      4. Изучить влияние бифидогенного концентрата «Лактусан» на органолептические свойства кисломолочных продуктов с учетом физиологической потребности человека в лактулозе, в количестве концентрата «Лактусан» 1; 2; 3 и 4 % от массы. В готовых образцах кисломолочных продуктов оценить органолептические показатели путем изучения внешнего вида, запаха, цвета, консистенции, вкуса.          5. Изучить влияние бифидогенного концентрата «Лактусан» на микробиологические показатели кисломолочных напитков методом микроскопирования и подсчета молочнокислых микроорганизмов по ГОСТ 10444.11–89.  По результатам исследований молоко-сырье для опыта имело содержание жира 5,62%, СОМО 8,46%,плотность 27,49°А, белок 3 %, титруемую кислотность 18°Т. Из полученных данных следует, что молоко относилось к 1 сорту. Такое сырье допустимо для выработки кисломолочных напитков.  Молоко, а также смесь молока и сиропа пастеризовали при температуре 90–92 °С, затем охлаждали до температуры заквашивания, для кефира она составляет 20–23°С, для ацидофилина – 28–32°С. Закваску вносили в количестве 5 % от массы напитка. Сквашивание проводили при оптимальных условиях развития заквасочной микрофлоры до достижения необходимой кислотности – для кефира 90–110°Т, для ацидофилина 75–80°Т. После сквашивания образцы охлаждали до 6±2°С.       Далее проанализировано влияние лактулозы на скорость кислотообразования кисломолочных напитков.

      Рисунок 1 – Схема про ведения исследований

На рисунок 2 представлены результаты эксперимента с образцом № 2 и № 4 с 2 %–м содержанием «Лактусана», введенного до и после пастеризации.

  Рисунок 2 – Влияние лактулозы  на скорость кислотообразования ацидофильной закваски: 1 − контрольный образец №2; 2 − образец №4 с 2% − м содержанием лактулозы, введенной до пастеризации; 3 − образец №4 с 2% − м содержанием лактулозы, введенной после пастеризации.        В целом, в опытных образцах с лактулозой, введенной до пастеризации, титруемая кислотность нарастает быстрее в сравнении с контролем на 1,5 − 2 часа. Необходимо также отметить, что в образцах с лактулозой, введенной после пастеризации, кислотность, напротив, нарастает медленнее в сравнении с контролем на 1 − 1,5 часа.         Для определения органолептических показателей была проведена дегустация готового продукта, в результате которой максимальную оценку получили образцы №3 и №4 (5 баллов) с концентрацией лактулозы 2% и 3%. Следует отметить, что у выше указанных образцов с лактулозой, внесенной до пастеризации, органолептические свойства наиболее выражены с насыщенным кремовым оттенком, характерным для ряженки. Образцы №1 и №2 отличались чрезмерным кислым привкусом, дегустационная оценка составила 3,5 − 4 балла.       При микроскопировании во всех образцах кефира присутствовали мезофильные молочнокислые стрептококки, при микроскопировании ацидофилина - только палочки.     Метод подсчета молочнокислых стрептококков и палочек проводили на третий день после приготовления продуктов. Анализировали образцы №1, №2, а также лактулозосодержащие образцы №3 и №4 с концентрацией лактулозы 2%, введенной до и после пастеризации. Использование метода подсчета дает возможность установить наличие в готовом продукте посторонней микрофлоры в количестве менее десятков тысяч в 1 куб.см., которое нельзя обнаружить методом непосредственного микроскопирования.  При этом во всех анализируемых образцах не было обнаружено посторонней микрофлоры, содержание молочнокислых микроорганизмов составило 10⁸.         В ходе эксперимента было выявлено, что дополнительный положительный эффект от применения бифидогенного концентрата «Лактусан», внесенного до пастеризации заключается в следующем:           − в связи с увеличением содержания сухих веществ быстрее нарастает кислотность и сокращается время сквашивания на 1 − 2 часа;             − свойства бифидогенного концентрата позволяют придать напитку характерные для ряженки вкус и цвет (кремовый оттенок и ореховый привкус), без использования энергоемкого процесса томления.          Преимущества использования бифидогенного концентрата «Лактусан», внесенного после пастеризации заключается в следующем:           − в связи с таким физико-химическим свойством лактулозы как сладость (слаще лактозы в 1,5 раза) возможна частичная замена сахара бифидогенным фактором, что с успехом можно применять при производстве йогуртов и его аналогов.    Таким образом, внесение лактулозы требует некоторой корректировки технологического процесса и при этом вырабатываемые напитки характеризуются улучшенными качествами с приобретением статуса продуктов функционального питания.