Полимеразные Цепные Реакции

Количество  специфического продукта реакции (ограниченного  праймерами) теоретически возрастает пропорционально 2ⁿ, где n – число циклов реакции. На самом деле эффективность каждого цикла может быть меньше 100%, поэтому в действительности:

P ~ (1+E)ⁿ ,

 

где Р –  количество продукта, Е – средняя  эффективность цикла.

Число «длинных»  копий ДНК тоже растет, но линейно, поэтому в продуктах реакции  доминирует специфический фрагмент. Рост требуемого продукта в геометрической прогрессии ограничен количеством  реагентов, присутствием ингибиторов, образованием побочных продуктов.

ПЦР –  высокочувствительный метод, поэтому  при наличии в исследуемом  образце даже ничтожного количества ДНК, случайно попавшей из одной реакционной смеси в другую, могут быть получены ложноположительные результаты. Это заставляет тщательно контролировать все используемые для ПЦР растворы и посуду. 

Основные  принципы подбора праймеров.

При создании ПЦР-тест-системы одной из основных задач является правильный подбор праймеров, которые должны отвечать ряду критериев:

1. Праймеры  должны быть специфичны. Особое  внимание уделяют 3'-концам праймеров,  т.к именно с них начинает  достраивать комплементарную цепь  ДНК Taq-полимераза. Если их специфичность  недостаточна, то, вероятно, что в  пробирке с реакционной смесью  будут происходить нежелательные  процессы, а именно, синтез неспецифической  ДНК (коротких или длинных фрагментов). Она видна на электрофорезе  в виде тяжелых или легких  дополнительных полос. Это мешает  оценке результатов реакции, т.к  легко перепутать специфический  продукт амплификации с синтезированной  посторонней ДНК. Часть праймеров  и дНТФ расходуется на синтез  неспецифической ДНК, что приводит  к значительной потере чувствительности.

2. Праймеры  не должны образовывать димеры  и петли, т.е. не должно образовываться  устойчивых двойных цепей в  результате отжига праймеров  самих на себя или друг с  другом.

 

1.4 Эффект "плато"

Следует заметить, что процесс накопления специфических продуктов амплификации по геометрической прогрессии идет лишь ограниченное время, а затем его  эффективность критически падает. Это  связано с так называемым эффектом "плато".

Термин  эффект “плато” используют для  описания процесса накопления продуктов  ПЦР на последних циклах амплификации.

В зависимости  от условий и количества циклов реакции  амплификации, на момент достижения эффекта  “плато” влияют утилизация субстратов (дНТФ и праймеров), стабильность реактантов (дНТФ и фермента), количество ингибиторов, включая пирофосфаты и ДНК-дуплексы, конкуренция за реактанты неспецифическими продуктами или праймер-димерами, концентрация специфического продукта и неполная денатурация при высокой концентрации продуктов амплификации.

Чем меньше начальная концентрация ДНК-мишени, тем выше риск выхода реакции на “плато". Этот момент может наступить  до того, как количество специфических  продуктов амплификации будет достаточно, чтобы их можно было проанализировать. Избежать этого позволяют лишь хорошо оптимизированные тест-системы.

 

 

 

 

 

Cтадии постановки ПЦР

 

2.1 Подготовка пробы биологического материала

Для выделения  ДНК используют различные методики в зависимости от поставленных задач. Их суть заключается в экстракции (извлечении) ДНК из биопрепарата и  удалении или нейтрализации посторонних  примесей для получения препарата  ДНК с чистотой, пригодной для  постановки ПЦР.

Стандартной и ставшей уже классической считается  методика получения чистого препарата  ДНК, описанная Мармуром. Она включает в себя ферментативный протеолиз  с последующей депротеинизацией и переосаждением ДНК спиртом. Этот метод позволяет получить чистый препарат ДНК. Однако он довольно трудоемок  и предполагает работу с такими агрессивными и имеющими резкий запах веществами, как фенол и хлороформ.

Одним из популярных в настоящее время  является метод выделения ДНК. Этот метод основан на использовании  для лизиса клеток сильного хаотропного  агента - гуанидина тиоционата (GuSCN), и последующей сорбции ДНК  на носителе (стеклянные бусы, диатомовая земля, стеклянное "молоко" и. т.д.). После отмывок в пробе остается ДНК, сорбированная на носителе, с  которого она легко снимается  с помощью элюирующего буфера. Метод удобен, технологичен и пригоден для подготовки образца к амплификации. Однако возможны потери ДНК вследствие необратимой сорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок. Особенно большое значение это имеет при работе с небольшими количествами ДНК в образце. Кроме  того, даже следовые количества GuSCN могут  ингибировать ПЦР. Поэтому при использовании  этого метода очень важен правильный выбор сорбента и тщательное соблюдение технологических нюансов.

Другая  группа методов пробоподготовки  основана на использовании ионообменников типа Chilex, которые, в отличие от стекла, сорбируют не ДНК, а наоборот, примеси, мешающие реакции. Как правило, эта  технология включает две стадии: кипячение  образца и сорбция примесей на ионообменнике. Метод чрезвычайно  привлекателен простотой исполнения. В большинстве случаев он пригоден для работы с клиническим материалом. К сожалению, иногда встречаются  образцы с такими примесями, которые  невозможно удалить с помощью  ионообменников. Кроме того, некоторые  микроорганизмы не поддаются разрушению простым кипячением. В этих случаях  необходимо введение дополнительных стадий обработки образца.

Таким образом, к выбору метода пробоподготовки  следует относиться с пониманием целей проведения предполагаемых анализов.

 

2.2 Амплификация

Для проведения реакции амплификации необходимо приготовить  реакционную смесь и внести в  нее анализируемый образец ДНК. При этом важно учитывать некоторые особенности отжига праймеров. Дело в том, что, как правило, в анализируемом биологическом образце присутствуют разнообразные молекулы ДНК, к которым используемые в реакции праймеры имеют частичную, а в некоторых случаях значительную, гомологию. Кроме того, праймеры могут отжигаться друг с другом, образуя праймер-димеры. И то, и другое приводит к значительному расходу праймеров на синтез побочных (неспецифических) продуктов реакции и, как следствие, значительно уменьшает чувствительность системы. Это затрудняет или делает невозможным чтение результатов реакции при проведении электрофореза.

 

Методы, основанные на полимеразной цепной реакции

 

3.1 Способ постановки ПЦР с использованием “горячего старта"

Чтобы уменьшить  риск образования неспецифических  продуктов реакции амплификации, используют подход, получивший название “горячий старт" (“Hot-start”). Суть его  состоит в предотвращении возможности  начала реакции до момента достижения в пробирке условий, обеспечивающих специфический отжиг праймеров.

Дело  в том, что в зависимости от ГЦ-состава и размера, праймеры имеют  определенную температуру плавления (Tm). Если температура системы превышает  Тm, праймер не в состоянии удерживаться на цепи ДНК и денатурирует. При  соблюдении оптимальных условий, т.е. температуры отжига, близкой к  температуре плавления, праймер  образует двухцепочечную молекулу только при условии его полной комплементарности  и, таким образом, обеспечивает специфичность  реакции.

Существуют  различные варианты реализации "горячего старта":

Внесение  в реакционную смесь Taq-полимеразы во время первого цикла после  прогрева пробирки до температуры денатурации.

Разделение  ингредиентов реакционной смеси  парафиновой прослойкой на слои (в  нижней части - праймеры, в верхней - Taq-полимераза и ДНК-мишени), которые  смешиваются при расплавлении парафина (~65-750С).

Использование моноклональных антител к Taq-полимеразе. Фермент, связанный моноклональными  антителами, становится активным лишь после стадии первой денатурации, когда  моноклональные антитела необратимо денатурируют и освобождают активные центры Taq-полимеразы.

Во всех перечисленных случаях, даже если неспецифический  отжиг произошел до начала температурного циклирования, элонгации не происходит, а при нагревании комплексы праймер-ДНК  денатурируют, поэтому неспецифические  продукты не образуются. В дальнейшем температура в пробирке не опускается ниже температуры плавления, что  обеспечивает образование специфического продукта амплификации.

3.2 Детекция молекул РНК

Возможность использования РНК в качестве мишени для ПЦР существенно расширяет  спектр применения этого метода. Например, геномы многих вирусов (гепатит С, вирус  инфлюэнцы, пикорнавирусы и т.д.) представлены именно РНК. При этом в  их жизненных циклах отсутствует  промежуточная фаза превращения  в ДНК. Для детекции РНК необходимо в первую очередь перевести ее в форму ДНК. Для этого используют обратную транскриптазу, которую выделяют из двух различных вирусов: avian myeloblastosis virus и Moloney murine leukemia virus. Использование  этих ферментов связано с некоторыми трудностями. Прежде всего, они термолабильны  и поэтому могут быть использованы при температуре не выше 42° С. Так как при такой температуре  молекулы РНК легко образуют вторичные  структуры, то эффективность реакции  заметно снижается и по разным оценкам приблизительно равна 5%. Предпринимаются  попытки обойти этот недостаток используя  в качестве обратной транскриптазы  термостабильную полимеразу, полученную из термофильного микроорганизма Thermus Thermophilus, проявляющего транскриптазную активность в присутствии Mn2+. Это единственный известный фермент, способный проявлять как полимеразную так и транскриптазную активность.

Для проведения реакции обратной транскрипции в  реакционной смеси также как  и в ПЦР должны присутствовать праймеры в качестве затравки и смесь 4-х дНТФ, как строительный материал.

После проведения реакции обратной транскрипции полученные молекулы ДНК могут служить мишенью для проведения ПЦР

 

 

 

Основные  разновидности и области применения

 

4.1 Разновидности ПЦР

1. «Вложенная» ПЦР (Nested PCR(англ.)) — применяется для уменьшения числа побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции.
2. «Инвертированная» ПЦР (Inverse PCR(англ.)) — используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНК рестриктазами с последующим соединением фрагментов (лигирование). В результате известные фрагменты оказываются на обоих концах неизвестного участка, после чего можно проводить ПЦР как обычно.
3. ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR, RT-PCR(англ.)) — используется для амплификации, выделения или идентификации известной последовательности из библиотеки РНК. Перед обычной ПЦР проводят на матрице мРНК синтез одноцепочечной молекулы ДНК с помощью ревертазы и получают одноцепочечную кДНК, которая используется в качестве матрицы для ПЦР. Этим методом часто определяют, где и когда экспрессируются данные гены.
4. Ассиметричная ПЦР (англ. Asymmetric PCR) — проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке.
5. Количественная ПЦР (Quantitative PCR, Q-PCR(англ.)) — используется для быстрого измерения количества определенной ДНК, кДНК или РНК в пробе.
6. Количественная ПЦР в реальном времени (Quantitative real-time PCR) — в этом методе используют флуоресцентно меченые реагенты для точного измерения количества продукта реакции по мере его накопления.
7. Touchdown (Stepdown) ПЦР (Touchdown PCR(англ.)) — с помощью этого метода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров на образование продукта. Первые циклы проводят при температуре выше температуры отжига, затем каждые несколько циклов температуру снижают. При определённой температуре система пройдёт через полосу оптимальной специфичности праймеров к ДНК.
8. Метод молекулярных колоний (ПЦР в геле, англ. Polony - PCR Colony) — акриламидный гель полимеризуют со всеми компонентами ПЦР на поверхности и проводят ПЦР. В точках, содержащих анализируемую ДНК, происходит амплификация с образованием молекулярных колоний.
9. ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК (англ. Rapid amplification of cDNA ends, RACE-PCR)
10. ПЦР длинных фрагментов (англ. Long-range PCR) — модификация ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (10 тысяч оснований и больше). Используют две полимеразы, одна из которых — Taq-полимераза с высокой процессивностью (то есть, способная за один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая — ДНК полимераза с 3'-5' эндонуклеазной активностью. Вторая полимераза необходима для того, чтобы корректировать ошибки, внесенные первой.
11. RAPD PCR (англ. Random Amplification of Polymorphic DNA PCR), ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК — используется тогда, когда нужно различить близкие по генетической последовательности организмы, например, разные сорта культурных растений, породы собак или близкородственные микроорганизмы. В этом методе обычно используют один праймер небольшого размера (20 — 25 п.н.). Этот праймер будет частично комплементарен случайным участкам ДНК исследуемых организмов. Подбирая условия (длину праймера, его состав, температуру и пр.), удается добиться удовлетворительного отличия картины ПЦР для двух организмов.

 

 

4.2 Применение полимеразной цепной реакции.

Использование метода ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний как бактериальной, так и вирусной природы имеет  колоссальное значение для решения  многих проблем микробиологии и  эпидемиологии. Применение этого метода также способствует развитию фундаментальных исследований в области изучения хронических и малоизученных инфекционных заболеваний.

ПЦР-метод  позволил разработать новые диагностические  тесты на генетические и инфекционные заболевания. В частности, его используют для ранней диагностики наличия  в организме вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), что не удается осуществить  другими методами. При этом не требуется  работать с радиоактивными изотопами, так как амплифицированный сегмент  вирусной ДНК выявляется напрямую после электрофоретического разделения ДНК и окраски их бромистым этидием.

Наиболее  рационально и эффективно применение ПЦР для обнаружения микроорганизмов  трудно культивируемых в лабораторных условиях, атипичных форм бактерий. К ним также относятся внутриклеточные  паразиты и микроорганизмы, способные  длительно персистировать в организме  хозяина. Высокоспецифичная, чувствительная и быстрая диагностика многих тяжелых заболеваний способствует не только их эффективному лечению, но и предотвращению распространения  инфекции.

Наиболее эффективно и экономически обоснованно использование метода в урогинекологической практике - для выявления хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллеза, микоплазменной инфекции; в пульмонологии - для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных  пневмоний, туберкулеза; в гастроэнтерологии - для выявления геликобактериоза ; в клинике инфекционных заболеваний - в качестве экспресс-метода диагностики  сальмонеллеза, дифтерии, вирусных гепатитов  В,С и G; в гематологии диагностируются цитомегаловирусная инфекция, вирус Эппштейн-Барра.

Особое практическое значение имеет  определение устойчивости микрофлоры к антибиотикам: тетрациклину и эритромицину с помощью ПЦР-диагностики, что обоснованно применять тогда, когда другие методы недостаточно эффективны или приемлемы .

В криминалистике ПЦР используют для сравнения  так называемых «генетических отпечатков пальцев». Необходим образец генетического  материала с места преступления — кровь, слюна, сперма, волосы и  т. п. Его сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Достаточно совсем малого количества ДНК, теоретически — одной копии. ДНК расщепляют на фрагменты, затем амплифицируют  с помощью ПЦР. Фрагменты разделяют  с помощью гель-электрофореза. Полученную картину расположения полос ДНК и называют генетическим отпечатком пальцев (англ. genetic fingerprint).