Полимеразные Цепные Реакции

На лизатах  индивидуальных сперматозоидов человека продемонстрирована возможность одновременно анализировать два локуса, расположенных  на разных негомологичных хромосомах. Такой подход обеспечивает уникальную возможность тонкого генетического  анализа и изучения хромосомной  рекомбинации, ДНК-полиморфизма и др. Метод анализа индивидуальных сперматозоидов сразу нашел практическое применение в судебной медицине, так как HLA-типирование  гаплоидных клеток позволяет определять отцовство.

ПЦР нашла  применение и в персонализированной  медицине. Известно, что большинство  лекарств действуют не на всех пациентов, для которых они предназначены, а лишь на 30-70 % их числа. Кроме того, многие лекарства оказываются токсичными или аллергенными для части пациентов. Причины этого — отчасти в индивидуальных различиях в восприимчивости и метаболизме лекарств и их производных. Эти различия детерминируются на генетическом уровне. Например, у одного пациента определенный цитохром (белок печени, отвечающий за метаболизм чужеродных веществ) может быть более активен, у другого — менее. Для того, чтобы определить, какой разновидностью цитохрома обладает данный пациент, предложено проводить ПЦР-анализ перед применением лекарства. Такой анализ называют предварительным генотипированием (англ. prospective genotyping).

Обсуждая  возможности ПЦР, необходимо рассмотреть  использование этого метода для  преодоления трудностей, возникающих  при диагностике возбудителей инфекционных заболеваний с характерным дрейфом  поверхностных антигенов. Многие патогенные бактерии, такие как гонококки, менингококки, боррелии, микоплазмы и ряд других, противостоят иммунной системе организма  хозяина, поскольку постоянно изменяют антигенную структуру поверхностных  детерминант, способных индуцировать протективный иммунный ответ. Молекулярный механизм, обеспечивающий постоянную изменчивость поверхностных структур, хорошо изучен и получил название кассетного механизма

Антигенный  дрейф позволяет микроорганизму постоянно уходить от атаки иммунной системы, пролонгируя инфекционный процесс, переводя его в хроническую  стадию. Однако при постоянной смене  антигенных детерминант начинают вырабатываться низкоавидные антитела на константные  части антигенов. Бактериальной  клетке необходимо принять решение  — сдаться в этой борьбе или  найти еще какой-либо механизм, позволяющий  уйти от атаки иммунной системы. Такой  механизм действительно существует. Используя технологию ПЦР, удалось  продемонстрировать, что у персистирующих форм микоплазм выключается экспрессия генов, кодирующих синтез антигенных детерминант, что, безусловно, отрицательно сказывается  на их потенции к размножению, но в  то же время дает возможность сохраниться, пролонгируя инфекционный процесс.

Из вышеизложенной стратегии взаимодействия бактерий с макроорганизмом совершенно очевидно, что как культуральные, так и  иммунологические методы диагностики  малоэффективны при обнаружении  бактерий, использующих такие способы борьбы с макроорганизмом. В то же время эти приспособительные реакции микроорганизма никак не влияют на эффективность диагностики, осуществляемой с помощью ПЦР.

В связи  с этим уместно привести данные по сравнительной оценке диагностической  эффективности различных лабораторных методов обнаружения Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealуticum при урологических и гинекологических заболеваниях. По этому вопросу имеется множество публикаций. Их обобщение показывает, что эффективность обнаружения Ureaplasma urealуticum при помощи ПЦР у больных с диагнозами хронических воспалительных заболеваний гениталий, бесплодия, простатита в 3 раза выше, чем у микробиологических методов выявления, и в 2 раза выше, чему у РИФ и РАГА. Вместе с тем их эффективность при обнаружении этих же бактерий при остром инфекционном процессе была примерно одинаковой. Аналогичные данные получены и для других микоплазм.

Таким образом, тест-системы, основанные на принципе ПЦР, гарантируют наиболее высокую  диагностическую эффективность  обнаружения персистирующих форм микроорганизмов. Более того, подходы, основанные на ПЦР, дают возможность непосредственно  работать с генетическим материалом микроорганизмов, находящихся в  этом физиологическом состоянии, что  уже сегодня позволяет изучать  молекулярно-генетические механизмы, определяющие стратегию взаимодействия персистирующих микробов с организмом хозяина.

Говоря  о диагностических возможностях ПЦР применительно к персистирующим формам микробов, нельзя обойти вниманием  проблему диагностики урогенитального  хламидиоза. При этом заболевании, вызываемом Chlamydia trachomatis, бессимптомное носительство является нормой. Какие молекулярные механизмы позволяют микроорганизму реализовать такую стратегию  выживания, неизвестно, но ПЦР начинает занимать лидирующее место в диагностике этого заболевания.

В настоящее  время преимущество ПЦР-анализа  перед «золотым стандартом» (культуральный  метод обнаружения микроорганизмов) состоит в следующем:

1. Более  высокая частота обнаружения  микроба, превышающая аналогичный  показатель при использовании  культурального метода, на 6—7%. Эти  различия объясняются возможной  гибелью микроба при хранении  и транспортировке, тогда как  ПЦР способна обнаруживать и  нежизнеспособные формы микроорганизма.

2. Время,  необходимое для обнаружения  возбудителя культуральным методом,  составляет около 4 суток, тогда  как использование ПЦР позволяет  обнаружить микроб через 4—5  часов.

3. Использование  технологии ПЦР позволяет проводить  определение возбудителей, например  хламидий, в образцах, взятых неинвазивным путем, например в порциях мочи.

Диагностика заболеваний, передающихся половым  путем, с помощью иммунологических и бактериологических методов существенно  затруднена, так как эта область  инфекционной патологии по понятным причинам насыщена стертыми, хроническими, недолеченными формами. Вместе с тем названные трудности не отражаются на эффективности диагностики, осуществляемой с применением ПЦР, поэтому можно прогнозировать, что ПЦР в ближайшее время займет лидирующие позиции в диагностике возбудителей инфекционных заболеваний, передаваемых половым путем.

В последнее  время технология ПЦР стала применяться  не только в целях диагностики  и оценки эффективности лечения, но и для выбора рациональной антибиотикотерапии. Использование ПЦР для определения  антибиотикорезистентности актуально  в случае труднокультивируемых микроорганизмов. В настоящее время уже описаны праймеры и тест-системы, позволяющие определять наличие генов, детерминирующих устойчивость к тетрациклину и эритромицину у целого ряда патогенных микроорганизмов.

Учитывая  вышесказанное, сформулируем направления  исследований в инфекционной патологии, в решении которых ПЦР начинает играть ведущую роль.

1. Диагностика  хронических инфекционных состояний,  обусловленных персистенцией бактерий  или вирусов. Это наиболее очевидная  область применения ПЦР в диагностических  целях.

2. ПЦР  — незаменимый инструмент при  идентификации и молекулярно-генетических  исследованиях практически всех  внутриклеточных и мембранных  паразитов, таких как вирусы, риккетсии,  хламидии, микоплазмы.

3. ПЦР  — наиболее эффективный метод  для выявления и изучения возбудителей, которые, находясь в «некультивируемом»  состоянии, способны там сохраняться,  переживая неблагоприятные внешние  условия.

4. ПЦР  позволяет проводить определение  антибиотикорезистентности у медленно  растущих и труднокультивируемых  бактерий.

Перспективными  направлениями практического использования  ПЦР-диагностики являются:

• диагностика онкологических заболеваний;
• диагностика лейкемий и лимфом;
• диагностика рака молочной железы;
• диагностика других злокачественных заболеваний;
• ДНК-диагностика доброкачественных и злокачественных новообразований ограничивается небольшим, но все возрастающим числом сведений о генах, ассоциированных с этими заболеваниями;
• диагностика генетических заболеваний.
• Диагностика генетических заболеваний может развиваться только вслед за проведением широких научных исследований генома человека. Однако медицинское сообщество уже осознало важность изучения генетической основы заболеваний, а также возможность диагностирования и начала лечения болезни до появления ее симптомов;
• идентификация личности: судебная медицина, криминалистика; трансплантация органов и тканей; определение отцовства. Эксперты оценивают это направление на рынке ДНК-диагностикумов как одно из наиболее крупных и быстрорастущих;
• диагностика патогенов в пище.

Сектор  рынка ДНК-диагностики патогенов  в пище в настоящее время является самым скромным. На ДНК-диагностику  микробного загрязнения производимых продуктов питания приходится менее 5% от общего числа методов, применяемых для тестирования загрязненности продуктов (культуральные методы и методы с использованием моноклональных антител). Однако методы ДНК-диагностики, по оценкам экспертов, более быстрые, точные и информативные, что в ближайшее время, по-видимому, приведет к резкому росту доли данного сектора рынка ДНК-диагностики.

Таким образом, технология ПЦР — мощный инструмент, обеспечивающий возможность изучения и диагностики хронических инфекционных процессов, экологии возбудителей инфекционных заболеваний. Метод ПЦР-диагностики  дополняет уже существующие приемы микробиологической диагностики, качественно  меняет методологию решения прикладных проблем медицинской микробиологии  и эпидемиологи.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Заключение

Самое широкое распространение  метод ПЦР в настоящее время  получил как метод диагностики  различных инфекционных заболеваний. ПЦР позволяет выявить этиологию  инфекции даже если в пробе, взятой на анализ, содержится всего несколько  молекул ДНК возбудителя. ПЦР  широко используется в ранней диагностики  ВИЧ-инфекций, вирусных гепатитов и  т.д. На сегодняшний день почти нет инфекционного агента, которого нельзя было бы выявить с помощью ПЦР.

 

 

 

Литература:

Электронный источник.

1. Статьи. ПЦР-анализ. ( Режим доступа http://mirzdorovja.by/articles/77-prc-analis)

Монографии

2. Глик Б., Пастренак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение – Москва: Мир, 2002.

Электронный источник

3. Анализ ПЦР. Полимеразно-цепная реакция. Метод ДНК-Диагностики. ( Режим доступа http://www.pcr.su/)

Монографии 

4. Щербо С.Н., Макаров В.Б. Клиническая лабораторная диагностика. — 1998.

Монографии 

5. Гинцбург А.Л. Микробиология, иммунология и вирусология. — 1999.