Процессы трансляции, репликации и трансформации

Министерство науки и образования Украины

Днепропетровский национальный университет им. Олеся Гончара

Факультет биологии, экологии и медицины

Кафедра микробиологии, вирусологии и биотехнологии

 

 

 

Аналитический обзор

Процессы трансляции, репликации и трансформации

 

                                                                         Выполнила:

                                                                         Ст. гр. БМ-13-5М

                                                                         Олейник А.А.

 

 

 

                                                                       Проверила:

                                                                     Жерносекова И. В.

 

 

 

 

 

 

Днепропетровск, 2013

ТРАНСЛЯЦИЯ

 

Синтез белка является основой жизнедеятельности клетки. Для осуществления этого процесса в клетках всех без исключения организмов имеются специальные органеллы — рибосомы.

Рибосомы представляют собой рибонуклеопротеидные комплексы, построенные из 2 субъединиц: большой и малой. Функция рибосом заключается в узнавании трёхбуквенных (трехнуклеотидных) кодоновом РНК, сопоставлении им соответствующих антикодонов тРНК, несущих аминокислоты, и присоединении этих аминокислот к растущей белковой цепи. Двигаясь вдоль молекулы мРНК, рибосома синтезирует белок в соответствии с информацией, заложенной в молекуле мРНК.

Для узнавания аминокислот в клетке имеются специальные «адаптеры», молекулы транспортной РНК (тРНК). Эти молекулы, имеющие форму клеверного листа, имеют участок (антикодон), комплементарный кодону мРНК, а также другой участок, к которому присоединяется аминокислота, соответствующая этому кодону. Присоединение аминокислот к тРНК осуществляется в энерго-зависимой реакции ферментами аминоацил-тРНК-синтетазами, а получившаяся молекула называется аминоацил-тРНК. Таким образом, специфичность трансляции определяется взаимодействием между кодоном мРНК и антикодоном тРНК, а также специфичностью аминоацил-тРНК-синтетаз, присоединяющих аминокислоты строго к соответствующим им тРНК (например, кодону GGU будет соответствовать тРНК, содержащая антикодон CCA, а к этой тРНК будет присоединяться только аминокислота глицин).

Механизмы трансляции прокариот и эукариот существенно отличаются, поэтому многие вещества, подавляющие прокариотическую трансляцию, в значительно меньшей степени действуют на трансляцию высших организмов, что позволяет использовать их в медицинской практике как антибактериальные средства безопасные для организма млекопитающих.

Процесс трансляции разделяют на

• инициацию — узнавание рибосомой стартового кодона и начало синтеза.
• элонгацию — собственно синтез белка.
• терминацию — узнавание терминирующего кодона (стоп-кодона) и отделение продукта.

Рамка считывания

Поскольку каждый кодон содержит три нуклеотида, один и тот же генетический текст можно прочитать тремя разными способами (начиная с первого, второго и третьего нуклеотидов), то есть в трех разных рамках считывания. За некоторыми интересными исключениями, значимой является информация, закодированная только в одной рамке считывания. По этой причине крайне важным для синтеза белка рибосомой является её правильное позиционирование на стартовом AUG-кодоне — инициация трансляции.

Инициация

Синтез белка в большинстве случаев начинается с AUG-кодона, кодирующего метионин. Этот кодон обычно называют стартовым или инициаторным. Инициация трансляции предусматривает узнавание рибосомой этого кодона и привлечение инициаторной аминоацил-тРНК. Для инициации трансляции необходимо также наличие определённых нуклеотидных последовательностей в районе стартового кодона (последовательность Шайна — Дальгарно у прокариот и последовательность Козак у эукариот). Немаловажная роль в защите 5'-конца мРНК принадлежит 5'-кэпу. Существование последовательности, отличающей стартовый AUG от внутренних совершенно необходимо, так как в противном случае инициация синтеза белка происходила бы хаотично на всех AUG-кодонах.

Процесс инициации обеспечивается специальными белками — факторами инициации (англ. initiation factors, IF; инициаторные факторы эукариот обозначают eIF, отангл. eukaryotes).

Механизмы инициации трансляции у про- и эукариот существенно отличаются: прокариотические рибосомы потенциально способны находить стартовый AUG и инициировать синтез на любых участках мРНК, в то время как эукариотические рибосомы обычно присоединяются к мРНК в области кэпа и сканируют её в поисках стартового кодона.

 

Инициация трансляции у прокариот

 

 

Рис. Схема инициации трансляции у прокариот.

 

Начальная стадия предусматривает связывание малой рибосомной субъединицы (30S) с мРНК. Это может происходить двумя способами: либо сначала к мРНК присоединяется комплекс, содержащий рибосомную субчастицу (1), а затем к нему привлекается тРНК в комплексе с IF2 и ГТФ (2), либо 30S субъединица изначально связывается с тРНК, а уже потом садится на мРНК (3). К образовавшемуся комплексу приходит большая (50S) рибосомная субъединица (4), инициаторные факторы отсоединяются от 30S субчастицы, что сопровождается гидролизом ГТФ белком IF2 (5), и собранная рибосома начинает элонгировать цепь (6). В правом нижнем углу дана схема инициаторного участка прокариотической мРНК. Отмечены 5' и 3' концы молекулы. RBS — сайт связывания рибосомы, SD — последовательность Шайна — Дальгарно, AUG — инициаторный кодон

 

Малая рибосомная субъединица (30S) прокариот, если она не вовлечена в данный момент в трансляцию, существует в комплексе с инициаторными факторами IF1, IF3, и, в некоторых случаях, IF2. Рассмотрим основные функции этих белков:

• IF3, связанный с 30S-субъединицей, предотвращает ассоциацию с большой (50S) субъединицей рибосомы, тем самым сохраняя её свободное состояние до связывания с матричной РНК. Этот белок также принимает участие в связывании мРНК и тРНК, а также IF2.
• IF2 взаимодействует с тРНК, а также обладает способностью расщеплять ГТФ.
• IF1 является, по-видимому, не обязательным фактором (у некоторых видов он отсутствует) повышающим сродство малой субчастицы к IF2 и IF3.

Комплекс 30S субчастицы с инициаторными факторами способен узнавать специальные последовательности мРНК, так называемые участки связывания рибосомы (англ. RBS, ribosome-binding site). Эти участки содержат, во-первых, инициаторный AUG, и, во-вторых, специальнуюпоследовательность Шайна — Дальгарно с которой комплементарно связывается рибосомная 16S РНК. Последовательность Шайна — Дальгарно служит для того, чтобы отличать инициаторный AUG от внутренних кодонов, кодирующих метионин. После того, как 30S-субъединица связалась с мРНК к ней привлекается инициаторная аминоацил-тРНК и IF2, если они ещё не были включены в комплекс. Затем присоединяется 50S-субчастица, происходит гидролиз ГТФ и диссоциация инициаторных факторов. Собранная рибосома начинает синтезировать полипептидную цепь.

 

 

 

Элонгация

В процессе наращивания полипептидной цепи принимают участие два белковых фактора элонгации. Первый (EF1a у эукариот, EF-Tu — у прокариот) переносит аминоацилированную («заряженную» аминокислотой) тРНК в А (аминоацил)-сайт рибосомы. Рибосома катализирует перенос пептида, связанного с тРНК в Р-сайте, в А-сайт и образование пептидной связи с находящимся там аминокислотным остатком. Таким образом растущий пептид удлиняется на один аминокислотный остаток. Затем второй белок (EF2 у эукариот, EF-G — у прокариот) катализирует так называемую транслокацию. Транслокация — перемещение рибосомы по мРНК на один триплет (примерно 20 ангстрем), в результате которого пептидил-тРНК оказывается вновь в Р-сайте, а «пустая» тРНК из P-сайта переходит в Е-сайт (от слова exit). тРНК из E-сайта диссоциирует спонтанно, после чего рибосома готова к новому циклу элонгации

Рис. РНК-связывающие участки рибосомы

 

        Схема РНК-связывающих участков рибосомы. Буквами обозначены участки связывания тРНК. А — аминоацил-тРНК-связывающий участок, Р — пептидил-тРНК-связывающий участок, Е — участок отсоединения тРНК от рибосомы.

Терминация

Терминация — окончание синтеза белка, осуществляется, когда в А-сайте рибосомы оказывается один из стоп - кодонов — UAG, UAA, UGA. Из-за отсутствия тРНК , соответствующих этим кодонам, пептидил-тРНК остаётся связанной с Р-сайтом рибосомы. Здесь в действие вступают специфические белки RF1 или RF2, которые катализируют отсоединение полипептидной цепи от мРНК, а также RF3, который вызывает диссоциацию мРНК из рибосомы. RF1 узнаёт в А-участке UAA или UAG; RF-2 — UAA или UGA. С UAA терминация эффективнее, чем с другими стоп-кодонами

 

Трансформация

 

Явление трансформации было открыто Ф. Гриффитом в 1928 г. в 
опытах на пневмококках (Streptococcus pneumoniae) – грамположитель- 
ных бактериях, относящихся к группе молочнокислых бактерий. Ко вре- 
мени открытия явления трансформации свойства пневмококков были 
изучены достаточно хорошо. В частности, было известно, что среди 
пневмококков одного и того же вида, кроме штаммов, имеющих полиса- 
харидную капсулу, обычно есть и бескапсульные варианты, получаю- 
щиеся в результате мутаций.

 

Было также установлено, что наличие и от- 
сутствие капсулы определяет некоторые важные свойства клеток. Клет- 
ки, обладающие капсулой, растут в виде так называемых S-колоний: сли- 
зистых, довольно крупных и с гладкой поверхностью. Бескапсульные 
клетки дают начало мелким, с неровной поверхностью (шероховатым) 
R-колониям. За счет наличия капсулы бактерии из S-колоний обладают 
вирулентными свойствами и вызывают септицемию, размножаясь прак- 
тически беспрепятственно в организме хозяина так как капсула защища- 
ет их от фагоцитирующих клеток. Бескапсульные клетки являются ави- 
рулентными.

 

 

 Было установлено, что  существует большое число различ- 
ных штаммов пневмококков, которые отличаются друг от друга по хи- 
мическому составу полисахаридной капсулы и которые можно различить 
серологически. Сейчас известно около 70 серотипов пневмококков. 
Трансформация была открыта в одном из вариантов опытов по имму- 
низации мышей вакциной, состоящей из пневмококков, убитых нагрева- 
нием при температуре 60–80 ºС. Ф. Гриффит обнаружил, что если мы- 
шам подкожно ввести смесь живых бескапсульных клеток (R) и убитых 
нагреванием вирулентных пневмококков (S), имеющих капсулу, то мы- 
ши погибают. Из органов мышей при этом можно выделить живые кап- 
сульные клетки пневмококков.

 

Рис. Схема вирулентности S и R штаммов пневмококка испытанная на белых крысах

 

Если мышам вводили живые авирулентные (R) клетки пневмококков 
и убитые вирулентные (S) клетки пневмококков разных серотипов (клет- 
ки имели разные антигены), то выделенные из органов мыши капсульные 
клетки имели измененный серотип – тот, к которому принадлежали уби- 
тые S-пневмококки. В контрольных опытах введение по отдельности та- 
кого же количества живых авирулентных пневмококков или убитых ви- 
рулентных не приводило к появлению живых капсульных форм. 
Чтобы доказать отсутствие случайного загрязнения бескапсульной 
культуры отдельными капсульными клетками, был поставлен экспери- 
мент с использованием клеток пневмококков, меченых специфическим 
соматическим белковым антигеном или маркерами лекарственной ус- 
тойчивости. Известно, что эти свойства клеток изменяются независимо 
от капсульного полисахарида. 
SII(M2′) RII(M2′) + SIII ///SIII(M2′)

Так было доказано отсутствие случайного загрязнения бескапсульной 
культуры отдельными капсульными клетками. 
На основании полученных результатов Ф. Гриффит сделал вывод, что 
существует трансформирующее начало, которое превращает бескапсуль- 
ные клетки одного серотипа в капсульные клетки другого серотипа.

В 1930 г. М. Даусон установил, что выдерживание суспензии клеток 
в течение двух суток при температуре 37 ºС уничтожает трансформи- 
рующую активность таких бактерий. В 1931 г. М. Даусон и Р. Сиа осу- 
ществили трансформацию не в организме мыши, а in vitro, смешав уби- 
тые нагреванием капсульные клетки и живые бескапсульные пневмокок- 
ки в жидкой питательной среде с добавлением крови. Позднее в 1932 г. 
Дж. Аллоуэй осуществил специфическую трансформацию in vitro в при- 
сутствии бесклеточных экстрактов, полученных из клеток S-типа. Пнев- 
мококки были разрушены замораживанием-оттаиванием или дезоксихо- 
латом натрия, и лизат несколько раз переосаждали спиртом. Полученный 
осадок растворяли и смешивали с бескапсульными живыми клетками, в 
результате с высокой частотой происходило образование капсульных 
клеток.

Таким образом, в работах 1928–1933 гг. доказано существование 
трансформации у пневмококков. Было установлено, что это явление мо- 
жет происходить как в организме животного, так и in vitro, а также, что 
для трансформации необходим какой-то фактор, который не инактиви- 
руется при обработке лизата клеток спиртом. 
Интерес к опытам по трансформации возродился в 1944 г., когда бы- 
ла опубликована классическая работа О. Эвери, К. Мак-Леода и М. Мак- 
Карти.