Теоретические основы электрофоретического разделения белковых смесей

Соотношение между акриламидом  и сшивающим агентом определяют механические и физические свойства геля. Для гелей с концентрацией  Т  5 – 15 % С рекомендуется выбирать в пределах 2-4 %.

Связь между подвижностью белков и концентрацией геля

Электрофоретическая подвижность  – это скорость движения частицы (обычно выражаемая в см/c) при напряженности электрического поля в 1 В/см. Эта величина имеет размерность см² × с^-1× В^-1, а её знак совпадает со знаком суммарного заряда макромолекулы.

Рассмотрим изолированную частицу, взвешенную в идеальном диэлектрике. Если приложить равномерное электрическое поле, то на частицу будет действовать сила, равная произведению общего заряда частицы на напряженность этого поля. При наложении электрического поля скорость движения частицы (биологической макромолекулы) довольно быстро увеличивается до тех пор, пока электрическую силу, действующую на частицу со стороны электрического поля, не уравновесит сила трения. После этого частица будет двигаться с постоянной скоростью.

В случае реального электрофореза  макромолекул, процесс происходит не в диэлектрике, а в растворе электролита.  При этом вокруг заряженной частицы  будет существовать ионная атмосфера. Частица при этом будет окружена диффузным облаком ионов, заряд которых противоположен заряду частицы. На значительных расстояниях от частицы суммарный заряд в любом элементе объема, достаточно большом по сравнению с атомными размерами частицы, равен нулю. Присутствие же ионной атмосферы вокруг частицы приводит к тому, что её электрофоретическая подвижность оказывается меньше, чем это предсказывается уравнением. Это обуславливается тремя причинами. Во-первых, потенциал на поверхности частицы снижается  из-за снижения её эффективного электростатического заряда. Во-вторых, электрическое поле действует также и на ионы, окружающие макромолекулярную частицу. Поскольку знак заряда ионного облака противоположен знаку заряда частицы, облако будет смещаться в направлении, противоположном движению частицы, замедляя тем самым её миграцию (эффект электрофоретического трения). В-третьих, имеет место замедляющий эффект другого рода, связанный с тем, что в электрическом поле одни ионы при перемещении приближаются к частице, а другие удаляются от неё. Вследствие этого в ионной атмосфере происходит непрерывное замещение ионов, что вызывает нарушение её сферически симметричной формы, так как для вновь входящих ионов требуется определённое время, чтобы найти своё место в поле макромолекулы и прийти в равновесие с её окружением. В результате двойной электрический слой позади частицы растягивается. Действие тормозящей силы такого типа носит название релаксационного эффекта.

Подвижность макромолекул в полиакриламидном геле обратно  пропорциональна среднему размеру  пор (формула Фергюсона):

 

Lg U = lg U₀ – K_r Т

 

K_r – коэффициент задержки;

U – подвижность макромолекул  в геле;

U₀ – подвижность макромолекул в свободном растворе;

Т – плотность геля (концентрация мономеров)

 

Диск-электрофорез в полиакриламидном геле

Для достижения максимального разделения используют диск-электрофорез – важное усовершенствование зонального электрофореза. (Термин «диск» относится не к форме полос, получаемых при использовании этого метода, а к неоднородности значений рН в системе, что приводит к прерывистому напряжению.) Метод состоит в том, что первоначальный тонкий слой образца (1-2 мм) концентрируется в сверхтонкую стартовую зону толщиной от 1 до 100 мкм.

Прибор для диск-электрофореза. 1 – крышка, 2 – образец или область образца, 3 – концентрирующий гель, 4 – разделяющий гель, 5 – верхний сосуд, 6 – буфер, 7 – нижний сосуд, 8 – стеклянная трубка.

 

Гель находится в вертикальной колонке и представляет собой три отдельные области: верхнюю, или область образца, среднюю, называемую прокладкой (концентрирующий гель), и нижнюю, состоящую из собственно разделяющего геля.

Область образца и концентрирующий  гель имеют меньшую концентрацию (больший размер пор), чем разделяющий  гель, и готовятся в буфере с  низкой ионной силой и различными значениями рН. Больший размер пор верхних слоев геля означает, что молекулы в них задерживаются меньше, двигаясь при этом быстрее, чем в нижнем геле. Кроме того, меньшая ионная сила обусловливает большее электрическое сопротивление, поэтому электрическое поле (В/см) в верхнем геле больше, что также приводит к большей скорости движения молекул в верхнем геле пo сравнению с нижним гелем. Соотношение значений рН по слоям приводит к такому же влиянию на подвижность. Быстрое движение макромолекул через верхние слои геля приводит к накоплению вещества на границе между концентрирующим и разделяющим гелями. Однако следует заметить, что в концентрирующем геле компоненты с близкими подвижностями все же группируются. [Этот процесс называется стэкинг-взаимодействием (stacking), поэтому концентрирующий гель иногда называют стэкинг-гелем.] При движении молекул через разделяющий гель образуются зоны различных белков в соответствии с их подвижностями. После окончания разделения гель удаляют из стеклянной трубки. Для идентификации зон применяют ряд методов. Гель можно окрашивать путем погружения в раствор красителя с последующим тщательным промыванием для удалении несвязанного красителя. Если требуется получить количественную информацию, количество связанного геля измеряют с помощью денситометра. В другом случае гель разрезают поперек на много слоев, каждый из которых либо анализируют на радиоактивность, либо измеряют оптическую плотность окращенной зоны при соответствующей длине волны.

Диск-электрофорез применяют в основном для определения чистоты предположительно чистых белков и для анализа компонентов смесей, когда необходимо получить очень высокое разрешение (то есть в случае присутствии очень большого числа компонентов).

 

 

 

 

 

 

 

 

Электрофорез  белков в вертикальных пластинах

 

Первые опыты с электрофорезом белков ставились в вертикально  стоящих трубочках. Для простоты изложения я в этой системе  рассматривал и основные особенности  электрофореза, не зависящие от формы  геля. Однако в ходе эксплуатации довольно скоро выяснилось, что система трубочек неудобна в двух отношениях. Во-первых, в трубочке трудно добиться одинакового охлаждения геля по всему ее сечению. Во-вторых, для сравнения результатов электрофореза нескольких сопоставляемых препаратов белков нужно было приготовить столько же отдельных трубочек в совершенно одинаковых условиях состава и полимеризации ПААГ, что затруднительно. Поэтому с середины 70-х годов электрофорез белков ведут исключительно в вертикально расположенных пластинах.

 

Рис. Вертикально расположенная пластинка: 2-прокладки, 3-пленка, 4-зажим

 

Обычно используют пластины шириной 8-14 см и длиной до 30 см. Полимеризацию  акриламида, а затем и сам электрофорез ведут в форме, образованной двумя  пластинами зеркального стекла толщиной 5 мм. Переднее стекло  имеет вырез.

Расстояние между пластинами, — а значит и толщина геля, — задается толщиной прокладок из тефлона (0,4-1,5 мм) при ширине 10-15 мм (на рисунке они показаны пунктиром). Эти прокладки устанавливают  по бокам и внизу формы, при условии плотного прилегания нижней прокладки к торцам боковых. Нижняя прокладка — немного выступает за пределы формы, поскольку после затвердевания геля ее надлежит удалить. Тефлон хорошо прилегает к зеркальному стеклу, а нижние торцы боковых прокладок можно слегка смазать силиконовым маслом. Прокладки между стеклами надежно зажимают по всей периферии пружинными зажимами для бумаг. (На рисунке показаны только 4 зажима с одной стороны пластины.) Вся камера таким образом должна быть надежно герметизирована, кроме верхнего ее края, на то время, пока в ней будет проходить полимеризация жидкой смеси предшественников ПААГ.

По окончании этого  процесса (о чем можно судить по образованию резкой границы между  гелем и тонким слоем воды, которым  защищают полимеризацию от контакта с кислородом воздуха) зажимы можно снять. Полимеризация занимает обычно 30-40 минут.

В аналитических опытах на каждой пластине в параллельных «треках» ведут электрофорез нескольких препаратов, состав которых затем  можно сопоставлять при строго одинаковых условиях разделения (рис.2 ).

 

Рис. Электрофорез нескольких препаратов

 

Для фиксации этих треков в ходе полимеризации на верхнем  крае геля формируют ряд одинаковых углублений прямоугольной формы  «карманов», куда затем и вносят различные препараты.

Для этого в еще  не заполимеризовавшийся гель вставляют  «гребенку» из тефлона, такой же толщины, как прокладки между стеклами. Как видно на разрезе, верхняя  часть гребенки делается немного  толще, чем нижняя (с зубцами). Это  удобно так как позволяет устанавливать гребенку каждый раз одинаково и ровно — до упора в торец стеклянной пластины. Жидкий гель заливают между пластинами с таким расчетом, чтобы при опускании гребенки до упора он заполнял бы промежутки между ее зубцами. Торцы зубцов гребенки перед установкой смачивают, потерев их об стекло с налитым на него жидким гелем. Кроме того начинают вставлять ее с некоторым перекосом, следя за тем, чтобы под зубцами не задержались пузырьки воздуха.

После завершения полимеризации  геля снимают зажимы, удаляют нижнюю прокладку и вынимают гребенку. Весь «сэндвич» сохраняет свою целостность благодаря прилипанию ПААГ к стеклу. Его устанавливают в простой прибор, склеенный из оргстекла — его нетрудно изготовить в лабораторных условиях. Так, чтобы то стекло формы геля, которое имеет вырез, прилегало к верхнему резервуару прибора. Вырезы в стекле и резервуаре совпадают, а второе, не вырезанное стекло формы геля, замыкает собой объем резервуара.

 

 

 

Его можно заполнять  буфером, который таким образом  попадает и в карманы геля. Естественно, что всю форму с гелем надо хорошо прижать к стенке прибора (лучше через резиновую прокладку), чтобы предотвратить вытекание буфера из верхнего резервуара. На дне коробки нижнего резервуара видна опора, на которую ставят пластины с гелем. Выемка на этой опоре обеспечивает контакт нижнего буфера с нижним торцом геля. Необходимо проверять, что на этом торце тоже нет пузырьков воздуха.

Препараты белков с добавленной  в них сахарозой или глицерином вносят в карманы геля после окончания  сборки прибора, осторожно подслаивая их. Препараты должны быть заведомо освобождены от пыли, нерастворившихся белков и других посторонних частиц фильтрованием или центрифугированием.

В верхнем и нижнем резервуарах для буфера видны  проволочки электродов. Через штырьковые разъемы их присоединяют к клеммам источника питания.

По окончании электрофореза  пластины разнимают, отслаивая одну из них от геля с помощью шпателя. Его всовывают между пластинами со стороны карманов и слегка поворачивают. Эту операцию не следует форсировать. Лучше сначала пройтись шпателем с легким нажимом вдоль всего верхнего края пластины, наблюдая за тем как между стеклом и гелем постепенно проникает воздух, а потом уже приподнять пластину. Со второй пластины гель снимают руками и переносят в ванночку для фиксации белков и их окраски. Эту простую операцию следует производить в перчатках. Случайное прикосновение руки к рабочей поверхности геля при современных высокочувствительных методах окрашивания может оставить на геле артефактное белковое пятно.

 

Электрофорез белков в полиакриламидном геле

в присутствии додецилсульфата натрия.

 

В середине 60-х годов  был разработан модифицированный метод  электрофореза - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата  натрия (ДСН-ПААГ). Этот метод был существенным шагом вперед по сравнению с обычными методами анализа белков, известными к тому времени.

При использовании данного  метода белки мигрируют в инертном матриксе - полиакриламидном геле с  высоким содержанием поперечных сшивок. Обычно гель готовят полимеризацией мономеров непосредственно перед использованием. Размеры пор геля могут быть подобраны произвольно с тем, чтобы гель мог замедлить миграцию определенных молекул. При этом белки находятся в растворе, содержащем мощный, отрицательно заряженный детергент - додецил-сульфат натрия или ДСН (SDS).Связываясь с гидрофобными участками белковой молекулы, этот детергент вызывает развертывание белковых молекул в длинные вытянутые цепи. Развертываясь, отдельные белковые молекулы освобождаются из комплексов с белками или молекулами липидов и стабилизируются в растворе детергента. В качестве восстанавливающего агента обычно добавляют меркаптоэтанол, разрушающий в белках связи S-S. Это дает возможность анализировать полипептиды, образующие мультисубъединичные молекулы. 
При нейтральном рН в 1%-ном SDS и 0,1 М меркаптоэтаноле большинство олигомерных белков связывают SDS и диссоциируют, дисульфидные связи разрываются меркаптоэтанолом, вторичная структура исчезает, в результате чего комплексы, состоящие из субъединиц белка и SDS приобретают беспорядочную конфигурацию. Обработанные таким образом белки имеют одну и ту же форму и одинаковое отношение заряд/масса. Это объясняется тем, что количество SDS, связываемое на единицу массы белка, всегда постоянно и равно 1,4 г SDS на 1 г белка: таким образом, заряд в бóльшей степени определяется SDS, чем различиями зарядов, присущих аминокислотам.

Смесь белков, растворенных в ДСН, подвергается электрофорезу  в блоке полиакриламидного геля. Каждая молекула белка связывает значительное количество негативно заряженных молекул детергента, общий заряд которых превосходит общий заряд белка. По этой причине белок после того, как будет приложено напряжение, начнет двигаться в направлении положительного электрода. Белки одного размера ведут себя сходным образом, поскольку, во-первых, их природная структура полностью нарушена ДСН так, что их форма идентична, во-вторых, они связывают одинаковое количество ДСН и приобретают одинаковый негативный заряд. Крупные белки, обладающие большим зарядом, подвергаются действию значительных электрических сил, а также более существенному торможению. В обычных растворах эти эффекты, как правило, взаимно погашаются, но в порах полиакриламидного геля, действующего как молекулярное сито, большие белки тормозятся значительно сильнее, чем малые белки. Вследствие этого сложная смесь белков делится на ряд полос, расположенных в соответствии с их молекулярной массой. Окрасив гель красителем кумасси синим, можно выявить основные фракции полипептидов. Минорные белки идентифицируют серебрением; минимальное количество белка, выявляемое в полосе, составляет в последнем случае 10 нг. С помощью таких гелей можно идентифицировать специфический белок, если пометить его антителами, связанными с радиоактивными изотопами, ферментами или флуоресцирующими красителями.