Физико-химические методы анализа антибиотиков

- пенициллины - группа природных и полусинтетических антибиотиков, молекула которых содержит 6-аминопенициллановую кислоту, состоящую из 2 колец - тиазолидонового и бета-лактамного. Среди них выделяют:

- биосинтетические (пенициллин G - бензилпенициллин);

- аминопенициллины (амоксициллин, ампициллин, бекампи-циллин);

- полусинтетические "антистафилококковые" пенициллины (оксациллин, метициллин, клоксациллин, диклоксациллин, флуклоксациллин), основное преимущество которых - устойчивость к микробным бета-лактамазам, в первую очередь стафилококковым;

- цефалоспорины - это природные и полусинтетические антибиотики, полученные на основе 7-аминоцефалоспориновой кислоты и содержащие цефемовое (также бета-лактамное) кольцо, т. е. по структуре они близки к пенициллинам. Они делятся на цефалоспорины:

- 1-го поколения - цепорин, цефалотин, цефалексин;

- 2-го поколения - цефазолин (кефзол), цефамезин, цефаман-дол (мандол);

- 3-го поколения - цефуроксим (кетоцеф), цефотаксим (кла-форан), цефуроксим аксетил (зиннат), цефтриаксон (лонга-цеф), цефтазидим (фортум);

- 4-го поколения - цефепим, цефпиром (цефром, кейтен) и др.;

- монобактамы - азтреонам (азактам, небактам);

- карбопенемы - меропенем (меронем) и имипинем, применяемый только в комбинации со специфическим ингибитором почечной дегидропептидазы циластатином - имипинем/цилас-татин (тиенам).

Аминогликозиды  содержат аминосахара, соединенные  гликозидной связью с остальной  частью (агликоновым фрагментом) молекулы. К ним относятся:

- синтетические аминогликозиды - стрептомицин, гентамицин (гарамицин), канамицин, неомицин, мономицин, сизомицин, тобрамицин (тобра);

- полусинтетические аминогликозиды - спектиномицин, амика-цин (амикин), нетилмицин (нетиллин).

Основу молекулы тетрациклинов составляет полифункциональное гидронафтаценовое соединение с  родовым названием тетрациклин. Среди них имеются:

- природные тетрациклины - тетрациклин, окситетрациклин (клинимицин);

- полусинтетические тетрациклины - метациклин, хлортетрин, доксициклин (вибрамицин), миноциклин, ролитетрациклин.

Препараты группы макролидов содержат в своей молекуле макроциклическое лактоновое кольцо, связанное с одним или несколькими углеводными остатками. К ним относятся:

- эритромицин;

- олеандомицин;

- рокситромицин (рулид);

- азитромицин (сумамед);

- кларитромицин (клацид);

- спирамицин;

- диритромицин.

К линкозамидам относятся линкомицин и клиндамицин. Фармакологические и биологические  свойства этих антибиотиков очень близки к макролидам, и, хотя в химическом отношении это совершенно иные препараты, некоторые медицинские источники  и фармацевтические фирмы - производители химиопрепаратов, например делацина С, относят линкозамины к группе макролидов.

Препараты группы гликопептидов в своей молекуле содержат замещенные пептидные соединения. К ним относятся:

- ванкомицин (ванкацин, диатрацин);

- тейкопланин (таргоцид);

- даптомицин.

Препараты группы полипептидов в своей молекуле содержат остатки полипептидных соединений, к ним относятся:

- грамицидин;

- полимиксины М и В;

- бацитрацин;

- колистин.

Препараты группы полиенов в своей молекуле содержат несколько  сопряженных двойных связей. К ним относятся:

- амфотерицин В;

- нистатин;

- леворин;

- натамицин.

К антрациклиновым антибиотикам относятся противоопухолевые антибиотики:

- доксорубицин;

- карминомицин;

- рубомицин;

- акларубицин.

Есть еще несколько  достаточно широко используемых в настоящее время в практике антибиотиков, не относящихся ни к одной из перечисленных групп: фосфомицин, фузидиевая кислота (фузидин), рифампицин.

Беталактамные антибиотики (b - лактамы) - самая большая группа антимикробных препаратов, включающая более 50 (25% от общего числа антибактериальных препаратов) наименований, объединенных наличием в их химической структуре b-лактамного кольца, отвечающего за антимикробную активность; при разрушении b-лактамного кольца антимикробная активность препарата теряется. Основные особенности и приемущества перед другими группами лекарственных средств связаны со способностью этих препаратов подавлять рост возбудителей инфекций без серьезного побочного воздействия на организм больного.

Концентрации антибиотиков в сыворотке крови и жидкостях организма человека должны соотносится с двумя основными подходами. Первый из них заключается в фармакокинетической оценке препаратов.

Определяя уровни препаратов в организме, можно установить характер всасывания, распределения, проникновения в ткани, метаболической деградации и экскреции антибиотиков. При втором подходе используются уровни концентраций антибиотиков в крови для модификации дозирования антибиотиков с целью достижения максимальной терапевтической эффективности и устранения дозозависимой токсичности [7].

Классификация b - лактамов по химическому строению приведена на рис.3. Большую часть b - лактамных антибиотиков составляют пенициллины и цефалоспорины. Основа всех пенициллинов представлена тиазолидиновым кольцом, соединенным с b - лактамным кольцом, имеющим аминогруппу (R–NH-). Путем изменения радикалов были созданы полусинтетические пенициллины, резистентные к b - лактамазам, кислотоустойчивые, активные в отношении грамотрицательных микроорганизмов.

 

Рис. 3. Классификация антибиотиков b - лактамного ряда по химическому строению

 

Пенициллины можно  подразделить на следующие подгруппы:

• Природные (феноксиметилпенициллин, бензилпенициллин);
• Аминопенициллины (ампициллин, амоксициллин);
• Пенициллиназостабильные (оксациллин, клоксациллин, диклоксациллин);
• Защищенные (амоксициллин/клавуланат, «Ампиокс»)

Новые перспективы  повышения эффективности b-лактамов открылись в связи с получением ингибиторов беталактамаз (клавулановая кислота, сульбактам). Их применение в комбинации со старыми пенициллинами (ампициллин, тикарциллин) повысило эффективность полусинтетических пенициллинов в отношении резистентных штаммов до уровня цефалоспоринов III поколения, расширило спектр их действия [8]. Сулациллин –комбинированный препарат, состоящий из ампициллина и ингибитора беталактамаз сульбактама в соотношении 2:1. Действующим началом сулациллина является ампициллин, второй компонент сочетания – сульбактам – самостоятельной антибактериальной активностью не обладает. Сульбактам в составе сулациллина восстанавливает антибактериальную активность ампициллина в отношении устойчивых возбудителей, расширяет его антимикробный спектр. Сулациллин по показаниям и терапевтической эффективности приближается к цефалоспоринам II – III поколения [9].

Основа всех цефалоспоринов представлена дигидротиазолидиновым  кольцом, соединенным с b - лактамным кольцом. Собственно антимикробная активность природных цефалоспоринов (цефалоспорин-С) низкая, однако присоединение различных радикалов в положении 7 и в положении 3 резко усиливает их биологическую активность и устойчивость к b-лактамазам.

Цефалоспорины принято делить на четыре поколения, отличающихся между собой по спектру  антимикробного действия.

Первое  поколение: цефазолин, цефалотин, цефалоридин - препараты для парентерального введения; цефрадин, цефалексин, цефадроксил - препараты для приема внутрь.

Второе  поколение: цефамандол, цефокситин, цефотетан, цефметазол, цефуроксим - для парентерального применения; цефуроксим аксетил, цефаклор - для приема внутрь.

Третье  поколение: цефотаксим, цефоперазон, цефтриаксон, цефтизоксим, цефтазидим, цефодизим, цефменоксим, цефиксим, цефоперазон, цефсулодин, цефтазидим. цефпирамид, цефпимазол - для парентерального применения: цефтибутен, цефетамет пивоксил, цефподоксим проксетил, цефдинир, цефиксим, цефпрозид - для перорального применения.

Четвертое поколение: цефпиром и цефепим.

Название и  формулы b-лактамных антибиотиков приведены в табл. 1.

 

Таблица 1. Название и химическая формула антибиотиков b-лактамного ряда

Антибиотик	Сокра-щение	Формула
Бензилпенициллин	Pen
Ампициллин	Am
Оксациллин	Ox
Амоксициллин	Amox
Цефодизим	Ced
Цефазолин	Cef
Цефотаксим	сtox

 

2.  Физико-химические методы анализа антибиотиков

 

Для качественной идентификации антибиотиков, в отличие  от ряда групп природных соединений (алкалоиды, гликозиды), не существует общих, групповых реакций. Различные антибиотики дают те или другие реакции, преимущественно цветные [10, 11].

Для идентификации антибиотиков в настоящее время широко используется спектральная характеристика.

Для количественного определения  антибиотиков используются различные  методы: биологические, химические, физико-химические.

Биологические методы основаны на непосредственном биологическом  действии антибиотика на применяемый  тест-микроорганизм, чувствительный к данному антибиотику.

Из биологических методов  количественного определения антибиотиков наибольшее распространение получил  метод диффузии в агар с турбидиметрическим определением, основанным на измерении  концентрации клеток тест-микроба, образующих определенную оптическую плотность среды (мутность) в результате их роста в присутствии небольшого количества антибиотиков.

Недостатками биологических  методов контроля являются затраты  большого количества времени на анализ, а также зависимость точности результатов анализа от многих внешних факторов [6-14].

В последние  годы широкое распространение для  количественного определения антибиотиков получили химические и физико-химические методы, из которых наибольшее применение имеют фотоколориметрический и спектрофотометрический методы. Последние основаны на использовании определенных свойств антибиотиков: цветные реакции, появление или исчезновение характерных полос в УФ- или ИК-областях спектра под воздействием различных реагентов (кислот, щелочей и др.).

Задача качественно  анализа определить неизвестный  антибиотик встаёт как при изучении новых антибиотиков, так и в  практике, если нужно показать присутствие  антибиотика в фармацевтических препаратах.

Многие антибиотики, как, например, пенициллин, стрептомицин, эритромицин, бацитрацин, неомицин, полимиксин и т. д., не являются химически индивидуальными веществами, а представляют собой смесь нескольких структурно сходных веществ. Бумажная хроматография и электрофорез на бумаге позволяют выделить эти составные части и отделить их количественно [13].

 

1.   Бумажная хроматография и электрофорез

Многие антибиотики, как, например, пенициллин, стрептомицин, эритромицин, бацитрацин, неомицин, полимиксин и т. д., не являются химически индивидуальными веществами, а представляют собой смесь нескольких структурно сходных веществ. Бумажная хроматография и электрофорез на бумаге позволяют выделить эти составные части и отделить их количественно [12-19].

Для изучения антибиотиков можно применять нисходящую, восходящую и горизонтальную хроматографию. Выбор системы растворителей зависит от химической природы антибиотика [12-16].

Зоны отдельных  антибиотиков выявляются на хроматограммах или электрофотограммах чаще всего  биоавтографически, т. е. методом, подобным определению антимикробной активности антибиотиков чашечным методом. Хроматограмму на узкой полоске фильтровальной бумаги после её высушивания кладут на лоток с твёрдой агаровой средой, засеянной суспензией тест-микроба. Лоток помещают на несколько часов в термостат при 37º. В ходе инкубации микроб, посеянный на агар, вырастает, так что агар мутнеет и становится молочно-белым. Он не растёт, однако, вокруг тех мест полосок фильтровальной бумаги, где находятся антибиотически активные вещества. В этих местах остаются чистые прозрачные округлые зоны, которые с первого же взгляда указывают на расположение антибиотически активных составных частей первоначальной смеси. Измеряя диаметр прозрачной зоны, можно установить и количество соответствующей составной части путём сравнения этого диаметра с диаметром зоны стандарта, хроматографируемого одновременно с анализируемыми образцами.