Физико-химические методы анализа антибиотиков

Этот метод  применяют для обнаружения антибиотиков и витаминов с той лишь разницей, что витамины выявляются положительно, т. е. микроб растёт  лишь в местах, где имеется витамин. Главным достоинством биоавтографии является её чувствительность, которая значительно превосходит чувствительность всех цветных реакций. В этом с нею сравним лишь метод флюоресценции. Это, однако, не говорит о том, что при хроматографировании антибиотиков для их обнаружения не применяют цветные реакции с помощью химических веществ. Этот способ применяют тогда, когда хотят определить составную часть антибиотика, химически подобную ему, но биологически неактивную.

В табл. 2 приведены основные способы хроматографии наиболее употребительных антибиотиков. Если же образец, помимо антибиотика, содержит ещё большое количество солей или иных примесей, то бумажная хроматография может и не дать хороших результатов. В этих случаях можно прибегнуть к электрофорезу на бумаге или же сочетать электрофорез с хроматографией [16].

Бумажная хроматография  и электрофорез незаменимы при контроле процесса получения антибиотиков путём  ферментации. Их главным достоинством является то, что они одинаково хорошо пригодны как для неочищенных растворов, так и для очищенных веществ. Это обусловлено прежде всего специфичностью биоавтографического метода. Ещё большее значение, нежели для технологии, имеет бумажная хроматография для изыскания и изучения новых антибиотиков.

 

 

Таблица 2. Бумажная хроматография антибиотиков

Антибиотик	Пропитка бумаги	Система растворителей	Проявление	Порядок следования составных частей
Пенициллины	Фосфатный буфер (рН=6,5)	Диэтиловый  эфир	Биоавтография (B. Sublitis), (PC-220)	X, G, G, дигидро-F, K
Пенициллины (как  гидроксамовые кислоты)		Изопропиловый эфир − изопропанол	Хлорное железо
Стрептомицин		н-Бутанол-пара-толуол-сульфоновая  кислота (2%)	Биография Реакция Сакагуши Реактив Вебера	Псевдострептомицин; дигидрострептомицин; стрептомицин В; стрептомицин А
Хлорамфеникол	Al2O3	Бензол −  метанол − вода (2:1:1)	15% хлорид олова  в HCl, затем парадиметил-аминобензальдегид	Хлорамфеникол и различные побочные продукты синтеза
Хлортетрациклин и тетрациклин	−	н-Бутанол −  уксусная кислота − вода (4:1:5)	Биоавтография (B. subtilis) (жёлтая флюоресценция в  ультрафиолето-вых лучах )	Тетрациклин, хлортетрациклин
Тетрациклиновые антибиотики	Фосфатный буфер (рН=3,0)	Этилацетат	Биоавтография. Парадиметиламинобензальдегид	Тетрациклин Окситетрациклин Хлортетрациклин
Эритромицин	−	Метанол − ацетон − вода (19:6:75)	Биоавтография	Эритромицин В Эритромицин
Актиномицин	−	н-Дибутиловый  эфир, эфир-этилацетат − 2%, водная паратолуолсульфоновая  кислота	Реактив Несслера	−

 

2.  Колориметрия и спектрофотометрия в видимом свете

Сюда относятся  наиболее часто применяемые методы количественного определения антибиотиков. Основным достоинством колориметрических  методов определения являются их простота, скорость и сравнительно высокая точность, недостатком − их малая специфичность [17-19].

Для колориметрического определения антибиотики превращают в окрашенные производные. При этом используют цветные реакции либо с самими антибиотиками, либо с продуктами их расщепления. Например, тетрациклиновые антибиотики образуют окрашенные комплексы с хлорным железом в кислой среде. Стрептомицин расщепляют едким натром до мальтола, который даёт цветную реакцию с хлорным железом или с реактивом Фелинга. Антибиотики группы фенола или ароматических аминов со свободным орто- или пара-положением можно обычно перевести в азокрасителе путём реакции с диазониевыми солями. Так можно определять, например, тетрациклиновые антибиотики.

Некоторые антибиотики  можно перевести в соединения с каким-либо красителем, затем выделить эти вещества из реакционной смеси и определить колориметрически. Так можно определять пенициллин с помощью N-(1-нафтил-4-азобензол)-этилендиамина.

 

2.3 Спектрофотометрия в ультрафиолетовом свете

Спектральный  анализ имеет большие возможности, нежели колориметрия. Большинству антибиотиков свойствен характерный спектр поглощения в ультрафиолетовой области, и поэтому  определять их спектрофотометрически  можно непосредственно [18]. Недостатком является то, что присутствие посторонних веществ мешает определению в значительно большей мере, нежели при колориметрии или спектрофотометрии в видимом свете, и поэтому определять антибиотики этим методом можно лишь в отдельно чистых образцах.

Можно повысить специфичность метода и сделать  его применимым к менее чистым препаратам путём измерения экстинкции при двух различных длинах волн, из которых одна находится на максимуме, а другая − при соседнем минимуме кривой экстинкции антибиотика. Этим путём зачастую удаётся установить влияние среды. Важно, чтобы все измерения проводились при строго определённом рН, поскольку спектр поглощения антибиотика в ультрафиолетовом свете очень сильно зависит от рН среды [18].

 

2.4 Инфракрасная спектроскопия

Этот метод  является специфичным для качественного  определения антибиотика. Его можно, однако, очень хорошо использовать и для количественного определения. Обычно достигается точность, равная точности спектрофотометрии в ультрафиолетовом свете, а в некоторых случаях даже ещё более высокая (±1%). Можно производить количественный анализ как растворов, так и твёрдых веществ. При анализе веществ в растворах необходимо выбрать подходящий растворитель, который сам бы не поглощал инфракрасные лучи в данной области. Обычно это бывает сероуглерод или же галоидопроизводные углеводородов. Поэтому антибиотик нужно иметь в такой форме, чтобы его можно было в этих веществах растворить. Если же подходящий растворитель найти не удаётся, можно провести спектрофотометрическое определение вещества в твёрдом состоянии. Твёрдые вещества либо таблетируют с бромистым натрием. Либо суспендируют в масле: измерение поглощения производят в тонких слоях этой суспензии [17, 19].

Для количественного  определения необходимо знать плотность слоёв этой суспензии. Её определяют путём добавления известного количества кристаллического вещества, например α-аланина, к суспензии антибиотика и измерения экстинкции при одном из максимумов поглощения добавленного вещества.

 

 

2.5 Флюорометрия

Это один из наиболее чувствительных методов определения  антибиотиков, приближающийся по своей  чувствительности к биологическим  методам. Главной областью его применения являются тетрациклиновые антибиотики, которые сами по себе флюоресцируют  жёлтым светом в умеренной щелочной среде; однако обычно измеряется синяя флюоресценция их продуктов разложения (в щелочной среде). Хлортетрациклин инактивируют щелочами, например 0,2 М тринатрийфосфатом, оставив смесь стоять в течение 30 минут при комнатной температуре, в то время как тетрациклин кипятят при этом в течение более продолжительного времени.

Антибиотики, которые  сами по себе не флюоресцируют и  не образуют флюоресцирующих продуктов  разложения, можно тем не мене определять флюорометрически путём соединения с подходящим флюоресцирующим веществом и выделения подходящего дополнительного соединения [17, 19].

 

2.6 Оптическое вращение

Поляриметрические методы дают очень надёжные результаты применительно к концентратам оптически  активных антибиотиков, если только они не слишком сильно окрашены. Вследствие удобства работы они получили очень широкое применение как обычные методы контроля, в особенности при выделении стрептомицина. Для определения антибиотиков в культуральной жидкости они непригодны, поскольку в этих случаях они малочувствительны.

Сконструирован  автоматический регистрирующий поляриметр, при помощи которого изучена кинетика разрушения пенициллина кислотами [17].

 

 

2.7 Электрохимические методы

Антибиотики, являющиеся кислота или основаниями, можно  титровать потенциометрически. Эти методы применяют сравнительно редко, поскольку с такими антибиотиками редко приходится иметь дело в этих формах. Исключение составляет, например, пенициллин.

Хлоргидраты тетрациклиновых  антибиотиков имеют сильно кислотные  свойства, напротив, основность этих антибиотиков очень слаба. Поэтому хлоргидраты можно титровать непосредственно алкалиметрически. После подтитровки хлоргидрата (достижения степени диссоциации свободной амфотерной формы антибиотика) на кривой потенциометрического титрования можно ясно видеть резкое изменение потенциала.

Намного большую  точность и значительно более  широкие возможности имеет потенциометрическое  титрование в неводных растворителях. Так, например, слабоосновные антибиотики, как тетрациклины, а также эритромицин и карбомицин, можно определять с помощью титрованного раствора хлористой кислоты в диоксане. Напротив, антибиотики с кислотными свойствами, пусть даже и очень слабыми, удаётся титровать в среде безводных оснований, например, в триэтаноламине.

Эти методы выгодны  тем, что они являются универсальными для целой группы антибиотиков. Конечно, они могут применяться исключительно  лишь для чистых веществ и готовых  препаратов [17, 19].

 

2.8 Полярография

Антибиотики, содержащие в своей молекуле восстанавливающиеся группы (например, нитрогруппы, кетогруппы, примыкающие к одной или более двойной связи, альдегидные группы, карбоксильные группы, примыкающие к двойным связям) либо имеющие хиноподобную структуру, могут быть восстановлены на ртутном капельном электроде и могут поэтому определяться полярографически. Сюда относятся прежде всего хлорамникол, далее − все тетрациклиновые антибиотики, стрептомицин, все хиноновые антибиотики, цитринин и туяплацины [19].

Другие антибиотики, напротив, окисляются на ртутном капельном электроде и могут поэтому давать анодную волну, которая также может служить для их количественного определения. Примером является гентизиловый спирт, производное гидрохинона.

Антибиотики, которые  сами по себе полярографически неактивны, можно перевести несколькими способами в полярографически активные вещества. Так, например, пенициллин гидролизуется сначала щёлочью или пенициллиназой и далее в кислой среде − до диметилцистеина. Эта аминокислота, содержащая группу − SH, даёт хорошо измеряемую волну в кобальтовом растворе Брдички.

Очень ценна  с аналитической точки зрения полярография хлорамникола. Этот антибиотик можно количественно определять полярографическим методом в  биологическом материале, как-то: в  крови и моче человека, в кутьтуральной жидкости [17, 19].

Следующей областью применения полярографии являются тетрациклиновые  антибиотики. Их можно определять количественно  в готовых продуктах и в  фармацестических препаратах. При соответствующем  выборе среды можно определять количественно  соотношение хлортетрациклина и окситетрациклина. Однако количественный анализ смеси хлортетрациклин и окситетрациклина лучше всего удаётся колориметрическим методом. В культуральной жидкости тетрациклиновые антибиотики определить нельзя, поскольку в этом случае определению мешает выделение водорода, катализируемое белками и другими веществами, присутствующими в фильтрате культуральной жидкости.

 

 

2.9 Амперметрическое (полярометрическое) титрование 

Каждый антибиотик, который осаждается полярографически активными веществами, можно титровать амперметрически. Определение это является более точным, однако значительно менен специфичным, чем обычная непосредственная полярография. Эти методы до настоящего времени применялись очень мало [19].

 

2.10 Кондуктометрия

Для прямого определения активности антибиотических препаратов можно использовать кондуктометрическое титрование. Этот метод до сего времени применялся очень мало, хотя несомненно, что на его основе возможно со временем обогатить анализ антибиотиков несколькими точными микроопределениями. Чаще кондуктометрия используется для определения зольности готовых антибиотических препаратов либо для контроля десорбции антибиотиков из ионообменных колонн (особенно стрептомицина).

 

2.11 Радиоактивные изотопы в анализе антибиотиков

В области антибиотиков сфера применении радиоактивных  и тяжёлых изотопов необычайно широка. Меченые препараты можно одинаково  широко применять как для аналитического контроля производства, так и для  решения основных проблем действия антибиотиков на микроорганизм и макроорганизм, для объяснения механизмов всасывания, циркуляции, накопления и выделения антибиотиков в теле. В области фармакологии и биохимии антибиотиков с помощью изотопов были достигнуты ценные результаты [17, 19].

Приготовление антибиотика, меченного изотопом, производится в процессе биосинтеза путём, в общем сходным с получением обычного антибиотика. Возможность специфической метки (т. е. локализации изотопа в одном определённом, заранее известном месте молекулы антибиотика) имеется лишь тогда, когда точно известен предшественник антибиотика и когда этот предшественник можно специфически пометить. Такая возможность имеется у бензилпенициллина, предшественник которого − фенилуксусная кислота с каким-либо изотопом углерода в карбоксильной группе − легко доступен. Если теперь при ферментации мы введём в качестве предшественника меченную таким образом фенилуксусную кислоту, то мы получим специфически меченный пенициллин.

Определение антибиотиков при помощи препаратов, меченных изотопами, проводят обычно методом разбавления изотопов. Этот способ применим для анализа образца любой химической природы, если только из него можно получить хотя бы небольшое количество чистого антибиотика. Например, к культуральной жидкости прибавляют заранее известное количество чистого меченого антибиотика с известной удельной радиоактивностью. При этом меченый препарат в определённой степени разбавляют антибиотиком, содержащимся в образце. Затем из жидкости выделяют антибиотик и несколько раз перекристаллизовывают до постоянно удельной радиоактивности. Поскольку изотопы нельзя определить простыми физическими методами, степень разбавления меченого препарата, содержащегося и в выделенном антибиотике, а также его удельная радиоактивность будут обратно пропорциональны содержанию антибиотика в культуральной жидкости [17, 19].