Хроматографические методы анализа

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ  МЕТОДЫ АНАЛИЗА

 

Теоретические основы                                                                                                                                        

 

Хроматография – это совокупность методов разделения и анализа  сложных смесей веществ, основанных на распределении веществ между  двумя фазами – подвижной (газ  или жидкость) и неподвижной (жидкость или твёрдое вещество).

Хроматография – гибридный  аналитический метод, сочитающий разделение и определение веществ в одном  приборе – хроматографе, содержащем хромотографическую колонну и детектор. Метод позволяет разделять многокомпонентную  смесь, идентифицировать компоненты и  определять её количественный состав.

В основу классификации многочисленных хроматографических методов положены следующие признаки: агрегатное состояние подвижной и неподвижной фаз (ГЖХ, ГТХ, ЖТХ, ЖЖХ); механизм взаимодействие сорбент-сорбат (распредилительная, ионнообменная, адсорбционная и др.); форма слоя сорбента (колоночная, бумажная, тонкослойная); цель хроматографирования (аналитическая, препаративная, тонкослойная); цель хроматографирования (аналитическая, препаративная, промышленная); по способу получения хроматограмм (элюентная, вытеснительная, фронтальная). В настоящее время имеются десятки разновидностей хроматографических методов анализа, которые продолжают совершенствоваться и развиваться.

 

Газожидкостная  хроматография

 

Газожидкостная хроматография  основана на избирательном распределении  веществ между двумя несмешивающимися фазами: газовой и жидкой. Подвижной  фазой является инертный газ-носитель, в поток которого вводится анализируемая  проба в виде газа (пара), а неподвижной  фазой – химически инертная нелетучая  жидкость, нанесённая в виде тонкого  слоя на поверхность твёрдого носителя, помещенного в хроматографическую колонку.

Анализируемая пробы вводится в испаритель, где она испаряется, затем подхватывается потоком газа носителя и, двигаясь по колонке, разделяется  на отдельные компоненты в результате избирательного распределения их между  несмешивающимися фазами: газовой и  жидкой.

Распределение веществ между  двумя фазами можно описать количественно  коэффициентом распределения к = c_n / c_н , где c_n и c_н – концентрации вещества соответственно в подвижной и неподвижной фазах. Это отношение, выражающее сущность закона Нернста, предполагает динамическое распределение, в котором молекулы вещества непрерывно переходят из одной фазы в другую. Если обозначить средние статистические времена пребывания молекул в подвижной и неподвижной фазах и , то

 

                                                       к  =                                            (1.1)                                     

 

В динамических условиях, когда  одна фаза перемещается относительно другой, молекулы вещества, находясь в  подвижной фазе, совершает вместе с ней перемещение относительно неподвижной фазы, а затем попадают в неподвижную и не перемещаются. В результате многократного повторения процесса молекулы различных веществ  проходят разные пути за одно и то же время. Молекулы веществ, у которых  больше, быстрее проходят путь вдоль неподвижной фазы и первыми выходят из колонки.

 

Количественный  анализ.Идентификация компонентов  анализируемой смеси

 

Качественный хпрпктеристикой каждого компонента в газо-жидкостной хроматографии является время удерживания (t) или удерживаемый объём (объём газа-носителя, необходимый для вымывания компонента пробы), которые не зависят ни от количества введённой пробы, ни от чувствительности детектора. Качественный анализ основан на сравнении времён кдерживания известных чистых веществ с временами удерживания компонентов пробы. Типичная хроматография трёхкомпонентной смеси представлена на рисунке 1. На хроматограмме времена удерживания пропорциональны отрезкам от точки начального отброса самописца (момент ввода пробы) ”a” до t₁, t₂, t_3.

 

 

Количественный  анализ

 

Количественный анализ в  газо – жидкостной хроматографии  может быть проведён различными методами (приёмами):

 

Метод нормализации площадей

Метод нормализации площадей может быть использован только в  том случае, если все компоненты смеси дают хорошо записанные хроматографические пики и имеют различные времена  удерживания.

Аналитическим сигналом в  газо-жидкостной хроматографии является площадь под хроматографическим пиком. Однако площадь под пиком  компонента пробы зависит не только от его содержания в пробе, но и  от объёма введённой пробы, а также  от чувствительности детектора к  компонентам пробы. Для этого  необходимо ввести в расчёт соответствующие поправки.

Влияние объёма введённой  пробы можно исключить, применяя приём расчёта, основанный на измерении  относительных площадей под пиками. Опытным путём установлено, что даже при широком варьировании объёма пробы отношения площадей под пиками для любой пары компонентов остаются неизменными. Поэтому при расчёте определяют относительные площади как отношение площади данного пика к сумме площадей всех пиков пробы  S_i / .

 

Определение площади  хроматографического пика

Площадь хроматографического  пика S определяют как площадь треугольника по формуле S = hd, где h – высота пика (рисунок 2) от базовой линии до вершины, мм;    d – отрезок прямой, параллельной базовой (нулевой) линии на высоте ½ h, замеренный от внешней стороны одной боковой линии пика до внутренней стороны другой, мм. Измерения проводят с помощью специальной измерительной лупы.

 

 

Определение калибровочных  коэффициентов

Наиболее распространённый способ определения калибровочных  коэффициентов заключается в  последовательном хроматографировании  серии бинарных смесей, составленных из определяемого компонента (i) и стандатра (ст), калибровочные коэффициенты рассчитываются по формуле:

 

                                                = ,                                                       (1.2)

 

где c_i и c_ст  - концентрация определяемого компонента и стандарта соответственно.

Калибровочный коэффициент  для стандартного вещества приравнивается к единице.

Калибровочные коэффициенты определяются следующим образом: из вещества, которые могут входить в состав анализируемой смеси, готовят калибровочную смесь с равным содержанием каждого из компонентов смеси. Например, смешивают толуол, ксилол, этилацетат, изопропилбензол и ацетофенон в соотношении 1:1:1:1:1 по массе или по объёму. Смесь готовят в колбочке с притёртой пробкой, отбирая, например, по 5см³ каждого компонента смеси с помощью пипетки (шприца) или, что более точно, взвешивая на аналитических весаъ точные навески анализируемых компонентов. Смесь хроматографируется, определяется площадь под хроматографическим пиком каждого компонента. Площади хроматографических пиков калибровочной смеси, имеющей одинаковые концентрации компонентов, отличаются друг от друга только вследствие различной чувствительности детектора к компонентам смеси.

Приняв калибровочный  коэффициент одного из компонентов  за единицу            (S₀ / S₀ = 1), можно выразить калибровочные коэффициенты других компонентов как отношения

 

                                                   = ,                                                    (1.3)

 

где S₀ – площадь под пиком, принятая за единицу;

      S_i – площадь под пиком i-ого компонента.

С помощью калибровочных  коэффициентов уравниваются произведения К_{i Si} для смесей с одинаковым содержанием компонентов.

Концентрация компонентов  в анализируемой смеси (пробе), %, рассчитывается по формуле:

 

                                                         ,                             (1.4)

 

где  K_i – калибровочный коэффициент i-ого комронента;

       S_i – площадь под пиком i-ого комронента.

 

Метод внутренней стандартизации (внутреннего стандарта)

Если анализируется сложная  смесь, и не все компоненты смеси  прописываются на хромотограмме, а  также в том случае, когда исследователя  интересует количественное содержание не всех, а одного или нескольких компонентов смеси (другие компоненты могут быть даже не идентифицированы), для анализа используют метод  внутреннего стандарта.

Для этого в анализируемую  смесь вводят известное количество определённого вещества (которого не было в анализируемой пробе), называемого  внутренним стандартом. Хроматографический пик стандарта должен быть свободен от наложения пиков компонентов  пробы, располагаться на хроматограмме  в непосредственной близости от пиков  определяемых соединений. Стандарт должен быть инертен по отношению к компонентам  анализируемой смеси, полностью  смшиваться с ними и по возможности  относиться к тому же гомологическому  ряду, что и анализируемые компоненты.

Количественный анализ заключается  в сопоставлении площадей под  пиками компонентов и стандарта.

Количество внутреннего  стандарта подбирается таким  образом, чтобы отношение параметров пиков стандарта и определяемого вещества было близким к единице.

Данный метод не требует  строгого дозирования заданных количеств  пробы и соблюдения постоянства  всех параметров режима хроматографирования.

Методика анализа. В колбочку с пришлифованной пробкой вносят стеклянными пипетками вместимостью около 2см³ (или чистым медицинским шприцем) пробу контрольной смеси ( 800 мг) и рекомендованного преподавателем (лаборантом) подходящего внутреннего стандарта – вещества, отсутствующего в анализируемой контрольной смеси ( 200 мг). Массы взятых навесок определяют на аналитических весах. Колбочку герметизируют и аккуратно перемешивают содержимое и снимают хроматограмму и обсчитывают её.

Содержание i-ого компонента в пробе, %, рассчитывают по формуле:

 

                  ,                                             (1.5)             

 

где  K_ст , S_ст – калибровочный коэффициент и площадь под пиком внутреннего стандарта;

          K_i , S_i  - калибровочный коэффициент и площадь под пиком анализируемого компонента;

          r -  отношение массы внутреннего стандарта к массе анализируемой пробы.

 

Метод стандартных добавок

Метод стандартной добавки  основан на том, что в навеску  контрольной смеси вносят точную навеску анализируемого вещества, присутствующего  в контрольной смеси, и снимают  хроматограммы исходной контрольной  смеси и контрольной смеси  с внесённой в неё стандартной  добавкой.

Методика анализа. В предварительно взвешенную колбочку с пришлифованной пробкой вносят пипеткой около 2 см³ контрольной смеси ( 800 мг) и взвешивают, а далее вносят одно из веществ ( 100 мг), присутствующих в контрольной смеси (по указанию преподавателя), и вновь взвешивают.

Далее снимают хромотограммы  исходной контрольной смеси и  контрольной смеси с внесённой  в неё стандартной добавкой определяемого  вещества. Измеряют на хроматограммах площади под пиком анализируемого компонента и рассчитывают результат  анализа по формуле:

 

                                              С(х) = С_ст ,                                          (1.6)

 

Где   S_x – площадь под пиком анализируемого компонента в пробе;

         S_x+ст – площадь под пиком анализируемого компонента в пробе после введения в пробу его стандартной добавки С_ст;

         С(х) – концентрация анализируемого компонента в пробе;

         С_ст – концентрация стандартной добавки анализируемого компонента,%:

 

                                                    С_ст  = ,                                            (1.7)

 

где   m_доб – масса добавки, г;

        m_пробы – масса хроматографируемой пробы, г.

 

Метод абсолютной градуировки (внешней стандартизации)

Метод абсолютной градуировки заключается в построении градуирочного графика зависимости площади холматографического пика (S) от содержания вещества в хроматографической пробе (m). Необходимым условием являются точность и воспроизводимость дозирования пробы, и строгое соблюдение режима работы хроматографа. Методом пользуются, когда следует определить содержание лишь отдельных компонентов анализируемой смеси и поэтому необходимо обеспечить полное отделение лишь пиков определяемых веществ от соседних пикоа на хроматограмме.

Готовят несколько стандартных  растворов определяемого компонента, одинаковые их количества вводят в  хроматограф и определяют площади  пиков (S₁,S₂,S₃). Результаты представляют графически (рисунок 3).