Генная инженерия

                                       ОГЛАВЛЕНИЕ

 

      ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………………….3

1 ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ: ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ……………………………….4

         1.1 Определение понятию «генная инженерия»……………………………….4

1.2 История развития генной  инженерии………………………………………4

2 ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ГЕННОЙ  ИНЖЕНЕРИИ…………………………6

2.1 Объекты генной инженерии………………………………………………...6

2.2 Основные этапы генной  инженерии………………………………………..6

3 ОПИСАНИЕ ОСНОВНЫХ ЭТАПОВ  ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ………...........8

3.1 Выделение генов…………………………………………………………......8

3.1.1 Химический синтез  генов…………………………………………………8

3.1.2 Выделение природных  генов……………………………………………...8

3.1.2.1 Рестриктазы………………………………………………………………8

3.1.2.2 Секвенирование………………………………………………………….9

3.1.3 Синтез генов путем  обратной транскрипции…………………………...11

3.2 Создание рекомбинантной  ДНК…………………………………………..11

3.3 Введение рекомбинантной  ДНК в клетку………………………………...13

4 ПРИМЕНЕНИЕ В МЕДИЦИНЕ……………………………………………….17

4.1 Генная терапия……………………………………………………………...17

4.2 Биотехнология гормонов…………………………………………………..18

ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………………21

 

 

 

 

 

 

 

                                   ВВЕДЕНИЕ

 

Генная инженерия - сравнительно молодое направление среди технологий, еще недостаточно освоенное человеком. Оно широко используется в настоящее время, но при этом имеет как положительные, так и отрицательные стороны. Человечеству необходимо окончательно разобраться с реакцией организма на трансгенную продукцию, будь ли это пища, лекарство или клетка с чужеродным генетическим материалом и найти пути избегания отрицательных  последствий генной инженерии. Поэтому данная тема очень актуальна и значима в настоящее время.

В своем реферате я бы хотела не просто рассказать о том, что вообще собой представляет генная инженерия, но и освятить многие другие стороны этого вопроса.

Цель моей работы: изучить основные принципы и этапы данного направления, рассказать о его особенностях, применении в медицине, преимуществах и недостатках и, конечно же, о перспективах развития.

Задачи исследования: сделать выводы, обобщить полученные факты.

Методы: посредством литературы найти интересующую информацию, притом  использовать сравнительно молодые источники, так как полученные данные будут близки к современному состоянию вопроса.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1 ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ: ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

 

1.1 Определение  понятию «генная инженерия»

 

На основании достижений молекулярной биологии, биохимии и генетики в последние десятилетия интенсивно развивается новое направление в генетике – генная инженерия, целью которой является конструирование генетических структур по заранее намеченному плану, создание организмов с новой генетической программой путем переноса генетической информации из одного организма в другой.[2]

Обычно употребляют два названия данного научного направления – генетическая инженерия и генная инженерия, являющиеся как бы синонимами. Однако их смысловое содержание неодинаково: генетическую инженерию связывают с генетикой, а генная имеет отношение только к генам.[1]

1.2 История развития генной инженерии

 

Генная инженерия имеет яркую историю благодаря тому общественному резонансу, который она вызвала с самых первых своих шагов. Начало этим событиям положило послание участников Гордоновской конференции (1973) президиуму АН США, в которой говорилось о возможной опасности технологий рекомбинантных ДНК для здоровья человека. Возможные блага генной инженерии признавались с самого начала, но разногласия по данной проблеме не затихли и сейчас. В таблице 1 перечислены основные этапы становления и развития генной инженерии.[1]

Таблица 1 Основные этапы развития генной инженерии

Год	Автор	Содержание открытия
1869	Ф.Мишер	Выделена ДНК из ядер клеток гноя
1953	Д.Уотсон, Ф.Крик	Сконструирована модель двойной спирали ДНК на основании результатов рентгеноструктурного анализа ДНК

 

Окончание таблицы 1

Год	Автор	Содержание открытия
1961	А. Мармур и П.Доти	Открыто явление ренатурации ДНК и установлены точность и специфичность реакции гибридизации нуклеиновых кислот
1962	В.Арбер	Впервые получены сведения о ферментах рестрикции ДНК
1968	М.Мезельсон и Е. Юань	Выделена первая рестриктаза
1966	М.Ниренберг, С. Очоа, Г. Корана	Расшифрован генетический код
1967	М. Геллерт	Открыта ДНК-лигаза
1972 - 1973	Г.Бойер, С. Коэн, П. Берг (Стендфорский университет и Калифорнийский университет в Сан-Франциско)	Разработана технология клонирования ДНК
1975-1977	Ф.Сэнгер, Р. Баррел, А.Максам, В.Гилберт	Разработаны методы быстрого определения нуклеотидной последовательности
1979	Г. Корана	Синтезирован ген тирозиновой супрессорной РНК
1981-1982	Р.Пальмитер, Р.Бринстер, А.Спрэдлинг, Г.Рубин	Получена трансгенная мышь. Получены трансгенные экземпляры дрозофилы
1993	Л.К. Эрнст, Г.Брем, И.В. Прокофьев	Получены трансгенные овцы с геном химозина

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2 ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ

 

2.1 Объекты генной инженерии

 

До перечисления этапов работы генного инженера укажем, что он должен иметь в своем распоряжении:

а) генетический материал (клетку-хозяина);

б) транспортное устройство – вектор, переносящий генетический материал в клетку;

в) набор специфических ферментов – «инструментов» генной инженерии.

Принципы и методы генетической инженерии отработаны, прежде всего, на микроорганизмах; бактериях – прокариотах и дрожжах – эукариотах.[4]

2.2 Основные этапы генной инженерии

 

Методы генной инженерии включают следующие основные этапы:

1) получение генетического  материала (выделение природных  генов или химический их синтез;

2) включение этих генов  в автономно реплицирующуюся генетическую структуру (векторную молекулу) и создание рекомбинантной ДНК;

3) введение рекомбинантных  молекул ДНК в клетку-реципиент  и включение  ее в хромосомный аппарат;

4) отбор трансформированных  клеток, в геном которых включен  переносимый ген.[2]

Ниже можно увидеть основные этапы и принципы генной инженерии в соответствии с рисунком 1.[5]

                                            

                                                                Рисунок 1

Принципы генной инженерии

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3 ОПИСАНИЕ ОСНОВНЫХ  ЭТАПОВ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ

 

3.1 Выделение генов

 

Возможно использование нескольких путей выделения генов. Каждый из них имеет свои достоинства и недостатки.

3.1.1 Химический синтез генов

 

Химический синтез генов т.е синтез нуклеотидов с заданной последовательностью, соответствующей одному гену, впервые был осуществлен в лаборатории Г. Кораны в 1969 г. Это был ген аланиновой т-РНК дрожжей размером в 77 п.н. В то время это было выдающееся достижение науки. Еще более значительным событием стал искусственный синтез гена тирозиновой т-РНК, проведенный тем же исследователем в 1976 г. Этот ген включал области промотора и терминатора, а главное. Он был биологически активен, т.е работал при введении в клетку.

Уже в 1980-е гг. были успешно синтезированы функционально активные гены инсулина, соматостатина, интерферона. Прогресс в этой области позволил разработать специальные автоматы для синтеза ДНК определенной последовательности.

3.1.2 Выделение природных генов

 

Получение отдельных генов из молекулы ДНК из природного генетического материала впервые осуществил Дж. Беквит в 1969 г, выделив гены лактозного оперона E. сoli.

3.1.2.1 Рестриктазы

 

 Главную роль в этом методе играют ферменты рестрикции (разрезания ДНК)-рестриктазы. Такие ферменты синтезируются практически всеми бактериями. Они относятся к группе ферментов-эндонуклеаз, которые делают разрезы в молекуле ДНК. Разные рестриктазы всегда разрезают ДНК в определенных местах – сайтах рестрикции, которые они способны узнавать.[3]

Все ферменты условно можно разделить на следующие группы:

1) используемые для получения  фрагментов ДНК;

2) синтезирующие фрагменты  ДНК на матрице РНК;

3) соединяющие фрагменты  ДНК;

4) позволяющие осуществить  изменение структуры концов фрагментов  ДНК;

5) применяемые для приготовления гибридизационных проб.

Согласно номенклатуре, предложенной Х.Смитом и Д. Натансоном, название рестриктазы складывается из трех букв: первая обозначает родовое название, две последующие – первые буквы вида. Например,фермент из E. coli обозначают как Eco или из Haemophilus influenzae – Hin и т.д. Типовая или штаммовая идентификация следует за родовидовой, например, EcoRI или HindII и т.д. В настоящее время различные фирмы выпускают более 100 разнообразных ферментов, опознающих различные последовательности нуклеотидов. Для каждого конкретного фермента они различаются по длине, первичной структуре и способу разрыва молекулы ДНК.[1]

 

3.1.2.2 Секвенирование

 

К 1977 г. А. Максамом, У. Гилбертом и Ф. Сэнджером были разработаны специальные методы определения нуклеотидных последовательностей ДНК, которые получили название секвенирование. Эти методы сыграли судьбоносную роль в становлении геномики и генной инженерии. Методы секвенирования основаны на создании набора одноцепочечных  фрагментов ДНК, оканчивающихся определенным нуклеотидом, для чего используются специфические рестриктазы. В настоящее время высокий уровень технического оснащения  сделал секвенирование достаточно рутинной лабораторной работой.[3]

Обычно используют два различных метода секвенирования ДНК: химический и ферментативный. Оба метода чрезвычайно надежны, быстры в исполнении и результативны. Результаты секвенирования позволяют также на основе генетического кода определить аминокислотную последовательность белка в соответствии с нуклеотидной последовательностью в соответствующем гене. Исходный фрагмент ДНК, меченный 32P по 5'-концу , подвергается специфическому расщеплению по определенному нуклеотиду (например, А), в результате чего образуются радиоактивные фрагменты разной длины, которые разделяются по размерам при гель-электрофорезе. А радиоактивные из них выявляются  с помощью радиоавтографии. Приведена схема химического метода секвенирования ДНК в соответствии с рисунком 2.

                                        Рисунок 2

      Схема химического метода секвенирования ДНК

Обычно химическая процедура расщепления ДНК выполняется одновременно для четырех одинаковых проб ДНК с использованием химических агентов, расщепляющих ДНК по отдельным нуклеотидам (Т, С, G и А).  Полученные образцы подвергают электрофорезу на параллельных дорожках одного геля, и по его результатам можно определить нуклеотидную последовательность ДНК.

Энзиматический метод секвенирования основан на энзиматическом введении нуклеотида, терминирующего полинуклеотидную цепь. В этом случае обычно используют дидезоксирибонуклеозидтрифосфаты, в которых дезоксирибоза-3'-OH, представленная в нормальных нуклеотидах, отсутствует. Такой модифицированный нуклеотид. Внедряясь в цепь ДНК с помощью ДНК-полимеразы, блокирует присоединение следующего нуклеотида. Синтез in vitro молекулы ДНК в присутствии затравки (праймера) и небольшого количества одного из таких модифицированных нуклеотидов приводит к образованию фрагментов ДНК в виде «лесенки». Если для получения таких фрагментов применять меченую ДНК(обычно проводят четыре реакции синтеза с использованием различных нуклеотидов, терминирующих цепь), а электрофоретический анализ проводить на четырех дорожках геля, то можно определить последовательность нуклеотидов. В настоящее время используют модифицированный метод, сводящийся к флуоресцентному анализу наборов фрагментов ДНК в процессе движения по одной дорожке геля.[1]

3.1.3 Синтез генов  путем обратной транскрипции

 

Синтез генов путем обратной транскрипции первоначально представлялся наиболее перспективным. Если известна хотя бы часть первичной структуры нужного белка, то можно синтезировать коллинеарную часть соответсвующего  гена. Такие участки получили название ДНК-зондов. Их применяют для поиска м-РНК. Имеющей комплементарный им участок. Выделенную с помощью зонда м-РНК можно использовать для синтеза комплементарной ДНК (к-ДНК) путем обратной транскрипции. После синтеза одной цепи с помощью ДНК-полимеразы можно синтезировать вторую цепь.

Большим недостатком этого метода является отсутствие регуляторных элементов в синтезированных генах, необходимых для экспрессии. К тому же часто к-ДНК является упрощенной копией гена, поскольку содержит только его кодирующую часть, т.е экзоны (без интронов).[3]

3.2 Создание рекомбинантной ДНК

 

Для переноса необходимого генетического материала используются особые структуры, способные переносить чужеродную ДНК  в клетку-реципиент – векторы. Ещё в начале развития генной инженерии векторы получили название «молекулярное такси». В качестве векторов могут использоваться два вида структур, содержащих ДНК: плазмиды и вирусы. ДНК вектора разрезают теми же рестриктазами, которые использовались для экзогенной ДНК.[3]