Клонирование эмбриональных стволовых клеток мыши с применением автоматизированного комплекса для скрининга и отбора клонов ClonePixFL

Министерство  образования и науки РФ

 

 

 

Учебная научно-исследовательская  работа на тему:

«Клонирование эмбриональных стволовых  клеток мыши с применением автоматизированного комплекса для скрининга и отбора клонов ClonePixFL»

 

Выполнила студентка очной формы  обучения

 

подпись

Руководитель  работы:  .

подпись

 

Москва 2013 

Оглавление

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 3

1.1. Введение 3

1.2. Характеристика эмбриональных стволовых клеток 4

1.2.1. Эмбриональные стволовые клетки мыши 4

1.2.2. Эмбриональные стволовые клетки человека 7

1.2.3. Другие эмбриональные стволовые клетки 9

1.3. Клонирование 9

2. Материалы и методы 12

2.1. Культуры клеток 12

2.2. Клонирование 12

2.3. Методика получения и окраски метафазных препаратов ЭСК (кариотипирование) 13

2.4. Иммуноцитохимическое окрашивание ЭСК и дифференцированных клеток, полученных из них 15

2.5. Определение активности эндогенной щелочной фосфатазы 16

2.6. Выделение ДНК и ПЦР 16

2.7. Выделение, очистка РНК и ОТ-ПЦР 17

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 18

3.1. Клонирование клеток 18

3.2. Фенотип колоний полученных клонов после разделения на ClonePix 19

3.3. Анализ полученных данных 19

3.4. Кариотипирование 21

3.5. Активность щелочной фосфатазы 21

3.6. Маркер SSEA-1 эмбриональных стволовых клеток 22

3.7. ПЦР GAPDH 22

4. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 23

 

 

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Введение

Стволовые клетки являются объектом пристального внимания исследователей с XX века, так как именно в эти годы были сделаны величайшие открытия, положившие начало возможности применения стволовых клеток в лечении гематологических, онкологических, неврологических и других заболеваний. Использование СК открывает перспективы трансплантации клеток, тканей и органов.

Термин "стволовая клетка" был введён Максимовым А. А., чтобы объяснить механизм быстрого самообновления клеток крови. Он сформулировал это положение в статье, опубликованной на немецком языке в 1909 году. Именно этот год можно по праву считать началом истории развития исследований стволовых клеток [1].

Однако ЭСК привлекли всеобщее внимание в 1998 году после изолирования бессмертных линий ЭСК человека Д.Томсоном и Д.Герхартом. В 1999 году журнал “Science” признал открытие ЭСК третьим по значимости событием в биологии после расшифровки двойной спирали ДНК и программы "Геном человека". Осознание важнейшей роли ЭСК в биологии и медицине состоялось в опережающем режиме, поскольку в открытой печати в 1999 году об ЭСК человека появилось не более 4-5 фундаментальных публикаций (хотя биологические компании в конце ХХ века уже получили более 2500 патентов на новые технологии и манипуляции с ЭСК). Представляют интерес мотивы и аргументы лидирующих биологов, поставивших открытие ЭСК так высоко в истории биологии ХХ века [2].

Одним из последних грандиозных открытий, связанных со стволовыми клетками, является исследования Ш. Яманака и Дж. Гёрдон в области биологии развития и получения индуцированных стволовых клеток. За эту работу они получили Нобелевскую премию в области физиологии и медицины в 2012 году.

1.2. Характеристика эмбриональных стволовых клеток

1.2.1. Эмбриональные стволовые клетки мыши

Первые линии ЭС клеток мыши были получены в начале 80-х годов XX века [3, 4]. Большинство из них были выделены из эмбрионов мышей на стадии бластоцисты инбредной линии 129/Sv. Такими линиями являются ЭС клетки линий: R1, W9.5, AB-1, CP-1, CCE, CC.1, PJ1-5, E14, D3 [5]. Кариотипический анализ 35 линий ЭС клеток мыши показал, что 25 из них имеют кариотип ХУ, а остальные ХО и ХХ. Предполагается, что ЭС клетки предпочтительней образуются из клеток с мужским кариотипом, так как вторая Х хромосома может быть дестабилизатором плюрипотентности [6]. В основном все ЭС клетки имеют нормальный кариотип (2n = 40), а его изменения ведут к потере плюрипотентности [7].

ЭС  клетки мыши обладают высокой пролиферативной  активностью и способностью поддерживаться в недифференцированном состоянии в течение длительного времени в культуре, при этом, как указывалось выше, они сохраняют нормальный и стабильный карио тип. Для ЭС клеток мыши характерно относительно короткое время удвоения клеточной популяции (примерно 12–15 ч), с очень короткой фазой G1. В этих популяциях преобладают клетки среднего размера (10–12 мкм); при пересеве они проявляют адгезивные и пролиферативные свойства, и, контактируя с фидером, формируют нормальные по внешнему виду монослойные колонии, способные при определенных условиях к дифференцировке в эмбриоидные тела. В начале дифференцировки ЭС клеток происходит возрастание экспрессии циклина D, удлиняется G1-фаза и, естественно, замедляется скорость клеточных делений [8]. Как уже отмечалось, для сохранения недифференцированного фенотипа ЭС клеток мыши в условиях in vitro клетки культивируют на фидерном слое, в качестве которого обычно используют первичные эмбриональные фибробласты, инактивированные митомицином С или гамма-облучением. Другой метод предупреждения дифференцировки ЭС клеток заключается в добавлении в культуральную среду (в отсутствие фидерного слоя) специфического ростового фактора LIF (фактор, ингибирующий лейкемию).

Некоторые свойства фактора, ингибирующего лейкемию

LIF относится к классу цитокинов и представляет собой гемопоэтический регулятор, индуцирующий дифференцировку клеток миелоидной лейкемии линии M1. Установлено, что клетки фидера из первичных эмбриональных фибробластов сами продуцируют LIF, обеспечивая этим поддержание недифференцированного состояния ЭС клеток [9]. В присутствии эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота рекомбинантный LIF может частично выполнять функции фидерного слоя, обеспечивая рост и пролиферацию ЭС клеток [10]. LIF является членом семейства интерлейкина-6 (IL-6), к которому относятся также: интерлейкин-11 (IL-11), онкостатин М, цилиарный нейротрофический фактор (CNTF) и кардиотрофин (СТ-1). Действие LIF на клетки осуществляется посредством его взаимодействия с соответствующим рецептором, представленным на плазматических мембранах гетеродимерным комплексом белков gp130 и LIFR. Вначале LIF взаимодействует со своим рецептором LIFR, затем с gp130, формируя, таким образом, тримерный комплекс [11], активирующий сигнальный путь транскрипционного фактора STAT3. Последний считается одним из основных в поддержании плюрипотентности ЭС клеток [12, 13]. Помимо сигнального пути, связанного с транскрипционным фактором STAT3, в поддержании недифференцированного статуса ЭС клеток может быть вовлечен BMP-SMAD путь. Недавно было показано, что в среде, не содержащей сыворотки, LIF способен блокировать нейрональную дифференцировку ЭС клеток мыши, сохраняя их плюрипотентность лишь в слабой степени. Однако совместное действие LIF и BMP сохраняет плюрипотентность ЭС клеток. Авторы предполагают, что основной вклад BMP связан с индукцией экспрессии Id генов с участием SMAD пути [14]. Следует также отметить, что существуют еще два пути, обеспечивающие поддержание недифференцированного состояния ЭС клеток: сигнальный путь ERK и Wnt-1 [15, 16].

Поверхностные антигены и поддержание плюрипотентности

Для ЭС клеток мыши характерна способность к экспрессии поверхностного антигена SSEA-1, прослеживаемая начиная с восьмиклеточной стадии эмбриона мыши до клеток внутренней клеточной массы бластоцисты [17]. Для сохранения плюрипотентности ЭС клеток мыши необходима экспрессия ряда транскрипционных факторов, в частности Oct-4, Nanog, Rex-1 [18–21]. Oct-4 – член семейства POU-белков, необходимый для формирования внутренней клеточной массы бластоцист, экспрессируется на ранних стадиях развития эмбрионов мыши [22]. Однако при повышении его экспрессии происходит дифференцировка ЭС клеток в мезодермальном и эндодермальном направлении, а его отсутствие приводит к образованию трофэктодермы [18]. Транскрипционный фактор Nanog также участвует в поддержании плюрипотентности ЭС клеток мыши; повышение его экспрессии способствует сохранению недифференцированного состояния ЭС клеток в отсутствие фактора LIF и соответствующей активации фактора STAT3.

Сохранение плюрипотентности ЭС клеток с повышенной экспрессией Nanog в отсутствие фактора LIF требует экспрессии Oct-4, так как при отсутствии последнего клетки начинают дифференцироваться [21, 23]. В [20] был проведен сравнительный анализ экспрессии гомеобокссодержащих транскрипционных факторов Oct-4, Paх-6, Prox-1, Ptx-2 в ЭС клетках мыши. В этой работе была впервые выявлена экспрессия генов Prox-1, Ptx-2 на начальных стадиях дифференцировки клеток, что может свидетельствовать о важной роли этих генов в эмбриогенезе.

Относительно  недавно было установлено, что некоторые нейротрофины (BDNF, NT-3 и NT-4) способны поддерживать как пролифе рацию, так и плюрипотентность ЭС клеток человека в культуре; кроме того, обнаружено, что они предотвращают апоптоз этих клеток [24]. Эффекты нейротрофинов на клетки осуществляются через сигнальный путь передачи информации, включающий, в частности, активацию фосфатидилинозитол-3-киназы.

Формирование  эмбриоидных тел

Начальные стадии дифференцировки

В отсутствие фидерного слоя и фактора LIF ЭС клетки формируют эмбриоидные тела, которые представляют собой зачатки эндодермы, эктодермы и мезодермы, напоминая при этом постимплантационное эмбриональное развитие. После прикрепления эмбриоидного тела к адгезивному субстрату разрушается система плотных контактов между поверхностными клетками, что влечет за собой нарушение целостности базальной мембраны и установлению контакта внутренних клеток с подложкой. Затем происходит миграция внутренних клеток из эмбриоидного тела и их активная пролиферация с последующей дифференцировкой в широкий спектр тканей, такие как мышечная, нервная, эпителиальная и др. [27]. ЭС клетки мыши способны формировать эмбриоидные тела двух типов: простые и цистические [25, 26]. Следует отметить, что дифференцировка ЭС клеток может происходить как спонтанно, так и под действием ряда ростовых факторов и различных химических соединений. Способность ЭС клеток к дифференцировке in vitro позволяет использовать их как модель для исследования процессов эмбриогенеза и соответствующей клеточной дифференцировки в разные типы тканей.

1.2.2. Эмбриональные стволовые клетки человека

Колоссальным достижением конца 90-х годов прошлого века явилось получение и выведение в культуру ЭС клеток человека. Клетки были выделены из предимплантационных бластоцист, оплодотворенных in vitro путем извлечения из них внутренней клеточной массы, которую затем помещали на фидерный слой, с последующим наращиванием клеток, из которых уже в дальнейшем получали соответствующие клеточные линии [2832]. Плюрипотентность ЭС клеток человека также поддерживается транскрипционными факторами Oct-4 и Nanog [24]. Аналогично ЭС клеткам мыши, ЭС клетки человека в течение продолжительного времени культивирования сохраняют плюрипотентность, высокую пролиферативную активность и, что особенно, важно нормальный карио тип(46XX/XY) [33]. Для этих клеток также характерна высокая активность эндогенной щелочной фосфатазы и теломеразы [28, 30]. Однако существует и ряд различий между ЭС клетками мыши и чело века. ЭС клетки человека в отличие от клеток мыши формируют только цистические эмбриоидные тела. Недифференцированные ЭС клетки человека экспрессируют специфические поверхностные анти гены SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 [28, 30, 34] и не экспрессируют антиген SSEA-1, характерный для ЭС клеток мыши.

Удвоение клеточной популяции  ЭС клеток человека составляет от 30 до 35 ч, что намного дольше, чем для ЭС клеток мыши (12–15 ч) [33]. Для пересева ЭС клеток мыши в большинстве случаев используют трипсин, а для клеток человека применяется в основном механический метод диссоциации, так как ферментативная обработка этих клеток нередко приводит к хромосомным абберациям [26].

Правда, относительно недавно было продемонстрировано получение 17 линий ЭС клеток человека с нормальным кариотипом при ферментативной обработке клеток [35]. При культивировании ЭС клеток человека in vitro также достаточно часто используется фидер из мышиных эмбриональных фибробластов, который выделяет необходимые для них факторы роста. Однако было показано, что LIF лишь слабо тормозит дифференцировку этих клеток, несмотря на то, что в ЭС клетках человека происходит активация LIF/STAT3 сигнального пути, но она, видимо, недостаточна для сохранения плюрипотентного статуса этих клеток [28, 29, 35].

1.2.3. Другие эмбриональные стволовые клетки

ЭСК были получены и из других животных, таких как курица [36], хомячок [37], кролик [38], крыса [39, 40], норка [41]. Однако только ЭС клетки цыпленка и мыши способны дифференцироваться в клетки зародышевого пути. Для развития исследований на ЭС клетках человека важно было иметь линии ЭС клеток и из других приматов. ЭС клетки обезьян характеризуются типичными маркерами ЭС клеток человека, сохраняя нормальный кариотип и высокую пролиферативную активность in vitro [42]. Эти линии могут служить удобной модельной системой для исследования ЭС клеток человека. Кроме того, линия ЭС клеток обезьяны (Cyno-1), выделенная из бластоцисты, полученной партеногенетическим путем in vivo, проявила многие свойства, присущие ЭС клеткам человека – высокую активность теломеразы и щелочной фосфатазы, экспрессию соответствующих клеточных маркеров (Oct-4, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81) и способность дифференцироваться в различные типы клеток. Эти результаты позволяют надеяться, что ЭС клетки, полученные партеногенетическим путем, могут служить источником для аутологической терапии, исключая необходимость создания эмбрионов. Однако использование линий, полученных этим способом, имеет и свои ограничения, поскольку в них могут происходить нарушения в экспрессии генов импринтинга [43].

1.3. Клонирование

Термин "клонирование" пришёл в русский язык из английского. Лишь немного изменив своё звучание и написание, он является аналогом английского clone, cloning. В самом же английском языке это слово стало употребляться (как биологический термин) менее 100 лет назад. Однако за этот небольшой для жизни слова срок оно уже успело несколько раз поменять своё значение.

"Клонирование" - получение потомков, являющихся точной генетической копией организма. Совокупность таких потомков-копий, происходящих от одного организма, называют клоном. Организмы в пределах каждого клона характеризуются одинаковой фенотипической однородностью и идентичным генотипом.

Термин  "клон" был впервые использован в 1903 году Веббером (Webber, Германия) применительно к растениям, размножаемым вегетативно, и означал, что дочерние растения клона генетически идентичны материнскому. В настоящее время разработки в области генной инженерии позволяют клонировать не только микроорганизмы и растения, но и животных. Впервые трансплантацию ядер соматических клеток зародышей в энуклеированные клетки лягушки осуществили американские исследователи Р. Бриггс и Т. Кинг в 1952 году. Ученые, пользуясь микропипеткой, удаляли ядра из яйцеклеток шпорцевой лягушки, а вместо них пересаживали ядра клеток эмбрионов, находящихся на разных стадиях развития. Проведенные исследования показали, что ядра ранних эмбрионов в стадии поздней бластулы и даже ранней гаструлы обладают тотипотентностью и обеспечивают нормальное развитие эмбрионов. Если брать ядра из клеток зародыша на ранней стадии его развития - бластуле, то примерно в 80% случаев зародыш благополучно развивается дальше и превращается в нормального головастика. Если же развитие зародыша, донора ядра, продвинулось на следующую стадию - гаструлу, то лишь менее чем в 20% случаев оперированные яйцеклетки развивались нормально. При пересадке ядер из более дифференцированных клеток (мезодермы и средней кишки) поздней гаструлы у эмбрионов наблюдалось недоразвитие и даже отсутствие нервной системы. После пересадки ядра из клеток более позднего развития яйцеклетки вообще не развивались [44]. 

Клонирование  при помощи разведения

Клеточной суспензи известной концентрации повторно разводилась в ростовой среде в 2 раза, с контрольным подсчетом в камере Горяева, до достижения концентрации 16,500 кл/мл. После этого повторные разведения осуществлялись без подсчета, до достижения расчетной концентрации 10-20 кл /мл [45].

Система ClonePix FL представляет собой комплекс анализатора колоний на планшетах в проходящем и отраженном свете (во всех наиболее используемых спектральных областях)  и роботизировнной системы переноса клеток. В отличие от традиционной методики клонирования гетерогенной клеточной популяции, при которой выживаемость клеток для многих клеточных культур невысока и, включающей в себя процедуру последовательных разведений (разреженного посева 1-10 клеток в лунку планшета) или подбора индивидуальных колоний и имеющей недостатки, связанные с потерей большой части клонов, отсутствием генетической однородности клонов (при наличии более 1 клетки в лунке), алгоритм работы ClonPix FL лишен этих недостатков.