Клонирование эмбриональных стволовых клеток мыши с применением автоматизированного комплекса для скрининга и отбора клонов ClonePixFL

Система ClonePix FL позволяет осуществить механический перенос неограниченного числа трансгенных колоний,  проводить выборку на основе размеров, морфологии колоний, собственной флюоресценции или окраски с помощью поверхностных антигенов.

Система ClonePix FL позволяет за ограниченный период времени эффективно осуществлять анализ и селекцию больших объемов клеточного материала [46]. 

2. Материалы и методы

2.1. Культуры клеток

Эмбриональные фибробласты мыши выделялись из 13-14 дневных эмбрионов мыши 129 линии по стандартной методике (Гордеева 2002).  Фибробласты культивировались на чашках Петри диаметром 35 мм в  среде DMEM (Gibco, США) c 10% фетальной бычьей сыворотки, 2мМ l-глутамина (ICN, США) и 80 мкг/мл гентамицина. Для получение фидерного слоя фибробласты обрабатывались митомицином С (1,5 часа, 3 мкг/мл) в ростовой среде и после этого три раза отмывались раствором Хенкса. На следующий день фидерные слои использовались для посева ЭСК.

ЭСК мыши линии R1 культивировались в среде α-MEM (Gibco, США), с 15% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ l-глутамина, и добавками 20 мкМ смеси витаминов, 100 мкМ заменимых аминокислот, 100 мкМ пирувата натрия, 80 мкМ меркаптоэтанола (ICN, CША) и 20 мкг/мл гентамицина. ЭСК культивировались в чашках Петри, которые обрабатывались 0,1% желатином, или на чашках с фидерным слоем эмбриональных фибробластов мыши.  При культивировании ЭСК на чашках покрытых желатином, в культуральную среду также добавлялся рекомбинантный LIF в концентрации 10 нг/мл.

Клетки PC12 культивировались в среде RPMI c 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 мM глутамина и 80 мкг/мл гентамицина.

Все клеточные культуры поддерживались  в CO₂ инкубаторе  в атмосфере 5% CO₂ и при температуре 37°С.

2.2. Клонирование

Система отбора и селекции клонов Clone Pix FL состоящая из фото/флуоресцентного детектора и пневматического робоманипулятора, позволяет сканировать и изолировать отдельные клоны из больших популяций клеток, основываясь на  морфологических критериях, экспрессии флуоресцентных маркеров и/или окраске с помощью флуоресцентно-меченых антител к поверхностным антигенам.

При проведении процедуры клонирования с помощью автоматизированной системы  Clone Pix FL, культуры ЭСК, подлежащих разделению,  высевались в 6-луночные планшеты Genetix по 6*10⁴ клеток на лунку в среду с LIF.  На 3 сутки планшеты с клетками размещались в приборе. После этого проводилось сканирование колоний и отбор отдельных клонов. Отдельными клонами считались колонии, находящиеся на расстоянии не менее 2 радиусов колонии друг от друга. Отбирались только округлые колонии, имеющие правильную морфологию и размеры 50-150 микрон. Отобранные колонии переносились на 96-луночные планшеты покрытые 0,1% желатином с 10 нг/мл LIF и культивировались 2 дня после чего производился пересев клеток.

2.3. Методика получения и окраски метафазных препаратов ЭСК (кариотипирование)

Растворы

Стоковый раствор колхицина 0.1 мг в мл DMEM (0,01%), ипользуется как 10X.

Гипотонический раствор, 0,075М КCl, прогревается до 37С перед использованием.

Фиксатор, («Метакарн», «Карнуа») –  25%  уксусной кислоты, 75% метанола

Стоковый раствор красителя -  получен растворением 60 мг Гимзы (метиленовый синий+Азур B-эозинат) в 6 мл метанола нагреванием до 60°С, разбавляется 6 мл глицерина.  Далее раствор фильтруется и используется как 10X, разводится 15% спиртом.

Среда aMEM c добавками глутамина, пирувата натрия, меркаптоэтанола, нуклеозидов, заменимых аминокислот, витаминов и 20% фетальной бычьей сыворотки для стимуляции пролиферации.

Методика.

ЭС клетки культивируются на чашках 35 мм покрытых желатиной, в присутствии  LIF 2 суток.

Когда клетки достигают экспоненциальной фазы роста, среда сменяется на такую же с 20% сыворотки и 0,01% колхицина и клетки культивируются еще 3 часа в CO2 инкубаторе.

После этого культуральная среда, содержащая неприкрепленные клетки собирается в пробирку, клетки промываются 2 раза раствором Версена, и этот раствор переносится в ту же пробирку.  Клетки обрабатываются 5 минут 0,25% раствором трипсина в растворе Версена, ресуспендируются пипетированием, и полученная суспензия объединяется в пробирке с отобранной средой и смывами,

Объединенная жидкость центрифугируется при 1500 об/мин в течнии 5 минут. Жидкость отбирается, клетки ресуспендируются в малом объеме среды

Постепенно, не допуская агрегации, добавляется  прогретый до 37С гипотонический раствор KCl. Клетки перемешиваются осторожно и инкубируются 20 минут в термостате.

Затем добавляется несколько капель фиксатора, суспензия перемешивается осторожно, и клетки центрифугируются 5 минут при 1500 об/мин.

Жидкость отбирается, но не досуха, осадок ресуспендируется в малом оставленном объеме, после чего добавляется 1 мл фиксатора,  и клетки инкубируются 15 минут

Суспензия центрифугируются 5 минут  при 1500 об/мин, жидкость отбирается не до конца, клетки ресуспендируются в малом объеме, дообавляется фиксатор, и далее 15 минут инкубируется и центрифугируется.

Осадок после центрифугирования  ресуспендируется в малом объеме фиксатора, с учетом концентрации клеток. Суспензию можно хранить 2 месяца при +4C.

Суспензия раскапывается с небольшой  высоты на сухие обезжиренные предметные стекла.

Капли высушиваются на воздухе.

Добавляется разведенный раствор  Гимзы,500 микролитров на стекло препараты накрываются парафильмом и инкубируются 50-60 минут при комнатной температуре.

Избыток краски стряхивается, препараты  высушиваются.

Препараты заключаются в безводную среду  и исследуются под микроскопом.

2.4. Иммуноцитохимическое окрашивание ЭСК и дифференцированных клеток, полученных из них

SSEA-1

Термин «антитело SSEA-1» относится к антителу, предпочтительно моноклональному антителу, которое специфически связано со стадиоспецифическим эмбриональным антигеном-1 (SSEA-1) (M. Buehr Exp. Cell. Res. 232:194-207 (1997)). SSEA-1 является углеводным эпитопом, (H. Gooi et al., Nature 292, 156-158 (1981)). Моноклональное антитело на SSEА-1 развивали посредством слияния клеток миеломы мыши с клетками селезенки мыши, которая была иммунизирована клетками тератокарциномы F9 (D. Solter and B.Knowles, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 5565-5569 (1978)). Антитело SSEA-1 известно как иммуногистохимический маркер.

Иммуногистохимические исследования проводили с использованием набора ABC-AP (Vector Laboratories, Burlingame, California). Клетки трижды промывали в PBS, всего в течение 30 минут. Затем их блокировали в 5% PBS, 0,25% тритона в течение 20 минут для уничтожения неспецифического связывания. Затем клетки инкубировали в течение часа с первичным моноклональным антителом на SSEA-1. Добавляли раствор вторичных антител к иммуноглобулинам мыши, конъюгированных с флуорисцентным красителем Alexa 568 (Invitrogen,  Америка) в PBS, инкубировали в течении часа  при 25. Трижды промывали дистиллированной водой от несвязавшихся антител. Покровные стёкла с окрашенными клетками помещали на предметное стекло в каплю глицирина, края покровного стекла замазывали лаком для уменьшения испарения. Полученные препараты исследовали с помощью прямого флуорисцентного микроскопа Axio Imager.Z1 (Zeiss,Германия) при длинах волны возбуждающего света 568 нм с применением соответствующих светофильтров.

2.5. Определение активности эндогенной щелочной фосфатазы

Анализируемые культуры клеток фиксировали метанолом  при +4°С 10 минут, промывали PBS, и обрабатывали окрашивающим раствором (2 mM BCIP,  2 mM NBT в 1 M диэтаноламине с 50 мМ MgCl₂; pH=9,8) в течении 12 минут.   Окрашивающий раствор удалялся, препараты промывались водой, заключались под покровные стекла,  и исследовались под микроскопом.

2.6. Выделение ДНК и ПЦР

ЭСК исследуемых линий стандартно снимались с чашек трипсином, клетки в суспензии подсчитывались. Клетки  (5*10⁵) осаждались центрифугированием, затем пипетировались в 60 мкл дистиллированной воды, нагревались до 100°С 10 минут, охлаждались на льду, обрабатывались раствором протеиназы K в дистиллированной  воде (4 мг/мл) 4 часа при 37°С. Лизаты центрифугировались, надосадочная жидкость отбиралась и использовалась в качестве матрицы для ПЦР.

ПЦР-анализ проводился с парами праймеров специфичными к клонированной последовательности. В качестве референсного гена использовался GAPDH. Условия реакции: 95°С -30 сек; 63°С – 30 сек; 72°C – 1 мин.

2.7. Выделение, очистка РНК и ОТ-ПЦР

Выделение тотальной РНК осуществлялось с  помощью наборов Рибозоль А (ИнтерЛабСервис, Россия) по протоколу данному производителем.  Образцы обрабатывали раствором ДНКазы I (Fermentas, EC) по модифицированному протоколу - 1,5  ч в реакционном буфере с 0,6 мМ MnCl₂, 40 мМ Tris, 1 mM CaCl₂. Затем ДНКазу инактивировали нагреванием (+65°С, 10 мин), а полученные образцы хранили при -70°С.  Обратная транскрипция проводилась с набором на основе M-MLV транскриптазы (Силекс, Россия) по протоколу данному производитем.  ПЦР проводилась с парами праймеров, специфичных к GAPDH, OCT4 мыши и ФРН человека.  Условия реакции во всех случаях: 95°С - 1 мин; 62°С – 1 мин; 72°C – 1,5 мин. 

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

3.1. Клонирование клеток

В ходе эксперимента были получены 2 клона  исходной культуры мышиных эмбриональных  стволовых клеток EF GFP: клон 3 и клон 5. Клонирование проводилось с использованием автоматизированной системы для селекции и отбора животных клеток Clone Pix FL (Molecular Devices, Англия).

 

Рис. 1. Флуоресцентное изображение клеток линии R1 EF-GFP при длине волны возбуждения 488 нм

Рис. 2. Колонии  клеток EF GFP в проходящем свете. Подбор колоний для клонирования

3.2. Фенотип колоний полученных клонов после разделения на ClonePix

 

Рис.3. Клоны ЭСК мыши после процедуры клонирования на аппарате ClonePix в 96-луночной плашке. 1-клон 3, 2-клон 5

3.3. Анализ полученных данных

После проведения процедуры клонирования и анализа зелёного флуорисцентного белка в полученных клонах проанализированы кариотип и экспрессия специфических маркеров эмбриональных стволовых клеток.

Экспрессия зелёного флуоресцентного  белка в недифференцированных и дифференцированных клетках.

Изучался уровень экспрессии трансгена GFP в недифференцированных клетках мыши и дифференцированных клетках на 21 день культивирования.

 

Рис.4 Экспрессия GFP в клонах. 1-GFP , 2-ядра, окрашенные DAPI, 3-наложение 1 и 2. 1,2,3-клон 3, 4,5,6-клон 5

 

Рис.5. Экспрессия GFP к клетках на 21 день дифференцировки. 1-GFP, 2-ядра, окрашенные DAPI, 3-наложение 1 и 2 

3.4. Кариотипирование

Подсчёт хромосом производился при  помощи программы ImageJ.

 

Рис.6. Ядра с диплоидным набором хромосом (40n).1-клон 3, 2-клон 5.

3.5. Активность щелочной фосфатазы

 

Рис.7. Колонии ЭСК мыши клон 5 с маркером щелочной фосфатазы 

3.6. Маркер SSEA-1 эмбриональных стволовых клеток

 

Рис 6. Окраска  поверхностными антителами к SSEA-1. 1-окраска на SSEA-1, 2-окраска DAPI, 3-наложение 2 и 3, 4-колонии клеток в проходящем свете

3.7. ПЦР GAPDH

 

Рис.7. Электрофореграмма GAPDH. 1-R1 NGF, 2-pcMT, 3-EF GFP, 4-э.т.  NGF, 5- э.т. GFP, 6-EF GFP к.3, 7-EF GFP к.5,8- Huh-7, 9-CH-1 

4. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. http://www.ctt-journal.com/1-3-en-maximow-1909-translation.html?&L=1

2. Репин В.С. Эмбриональная стволовая клетка (от фундаментальной биологии к медицине), Усп. физиол. наук, 2001, 32, 3-19.

3. Evans, M.J., Kaufman, M.H. (1981) Nature, 292, 154–156.

4. Martin, G.R. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 78, 7634–7638.

5. Joyner, A.L. (1993) IRL PRESS at Oxford University Press, p. 109.

6. Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. (1986) Nature, 323, 445–448.

7. Миталипов Ш.М., Миталипова М.М., Иванов В. И. (1994) Онтогенез, 25, 19–27.

8. Savatier, P., Lapillone, H., van Grunsven, L.A., Rudkin, B.B., Samarut, J. (1996) Oncogene, 12, 309–322.

9. Rathjen, P., Nichols, J., Toth, S. Edwards, D.R., Heath, J.K., Smith, A.G. (1990) Genes Dev., 4, 2308–2318.

10. Keller, G. (2005) Genes. Dev., 19, 1129–1155.

11. Zhang, J.G., Owerzarek, C.M., Ward, L.D., Howlett, G.J., Fanri, L.J., Roberts, B.A., Nicola, N.A. (1997) Biochem. J., 325, 693–700.

12. Burdon, T., Chambers, I., Stracey, C., Niwa, H., Smith, A. (1999) Cells Tissues Organs, 165, 131–143.

13. Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. (1998) Genes Dev., 12, 2048–2060.

14. Ying, Q.L, Nichols, J., Chambers, I.,Smith, A. (2003) Cell, 115, 281–292.

15. Burdon, T., Smith, A., Savatier, P. (2002) Trends Cell Biol., 12, 432–438.

16. Sato, N., Meijer, L., Skaltsounis, L., Greengard, P., Brivanlou, A.H. (2004) Nat. Med., 10, 55–63.

17. Solter, D., Knowles, B.B. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 5565–5569.

18. Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A.G. (2000) Nat. Genet., 24, 372–376.

19. Гордеева О.Ф., Мануилова Е.С., Гривенников И.А., Гуляев Д.В., Смирнова Ю.А., Зиновьева Р.Д., Хрущов Н.Г. (2002) Докл. Акад. Наук, 386, 555–558.

20. Гордеева О.Ф., Мануилова Е.С., Гривенников И.А., Смирнова Ю.А., Красникова Н.Ю., Зиновьева Р.Д., Хрущов Н.Г. (2003) Онтогенез, 34, 174–182.

21. Mitsui, K., Tokuzawa, Y., Itoh, H., Segawa, K., Murakami, M., Takahashi, K., Maruyama, M., Maeda, M., Yamanaka, S. (2003) Cell, 113, 631–642.

22. Nichols, J., Zevnik, B., Anastassiadis, K., Niwa, H., Klewe-Nebenius, D., Chambers, I., Scholer, H., Smith, A. (1998) Cell, 95, 379–391.

23. Chambers, I., Colby, D., Robertson, M., Nichol,s J., Lee, S., Tweedie, S., Smith, A. (2003) Cell, 113, 643–655.

24. Pyle, A.D., Lock, L.F., Donovan, P.J. (2006) Nat. Biotech., 24, 344–350.

25. Doetschman, T.C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. J. (1985) Embryol. Exp. Morphol., 87, 27–45.

26. Wei, H., Juharsz, O., Li, J., Tarasova, Y.S., Boheler, K.R. (2005) J.Cell. Mol. Med., 9, 804–817.

27. Martin, G.R., Evans, M.J. (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 72, 1441–1445. ho28.

28. Thomson, J.A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S.S., Waknitz, M.A., Swiergiel, J.J., Marshall, V.S., Jones, J.M. (1998) Science, 282, 1145–1147.

29. Reubinoff, B.E, Pera, M.F., Fong, C.Y., Trounson, A., Bongso, A. Nat. Biotechnol., 18, 399–404.

30. Крылова Т.А., Зенин В.В., Мусорина Н.С., Баранов В.С., Бичевая Н.К., Корсак В.С., Никольский Н.Н., Пи- на ев Г.П., Полянская Г.Г. (2003) Цитология, 45, 1172–1178.

31. Прыжкова М.В., Лагарькова М.А., Лякишева А.В., Ревазова Е.С., Гнучев Н.В., Киселев С.Л. (2004) Ин-

Эмбриональные стволовые клетки… 217 формационный бюллетень «Клеточные культуры», 19, 22–25.

32. Mitalipova, M., Calhoun, J., Shin, S., Wininger, D., Schulz, T., Nogglee, S., Venabler, A., Lyons, I., Robins, A., Stice, S. (2003) Stem Cells, 21, 521–526.