Методы культивирования, индикации и идентификации вирусов

                                                                                                   Таблица 3

                  Схема титрования вируса методом  цветной пробы    

2. Применение реакции гемагглютинации (РГА), реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и биологических моделей для индикации и идентификации вирусов

      Гемагглютинация,  вызываемая вирусами, не является  иммунологической реакцией, так  как здесь нет системы антиген  – антитело. С помощью этой реакции легко выявить присутствие гемагглютинирующего вируса, но невозможно его идентифицировать. Вирусы, обладающие гемагглютинирующими свойствами, имеют на поверхности гемагглютинины, с помощью которых происходит склеивание эритроцитов. По своей химической природе гемагглютинины являются глико- или липопротеидами.

       В  процессе взаимодействия вирусов  с эритроцитами различают стадии  адсорбции, агглютинации и элюции. Адсорбция вирусов на эритроцитах  начинается как неспецифическая,  а затем переходит в специфическую вследствие сродства гемагглютининов к рецепторам эритроцитов. На одном эритроците адсорбируется множество вирусов, они образуют мостики между эритроцитами, изменяется электростатический заряд эритроцитов и в результате наступает следующая стадия взаимодействия – гемагглютинация, на которой процесс может остановиться. Некоторые вирусы способны к элюции – освобождению с поверхности эритроцитов. Элюция происходит под действием вирусных ферментов (например, нейраминидазы) на рецепторы эритроцитов. Элюированные вирусы при этом не повреждаются, эритроциты же не способны повторно адсорбировать вирус вследствие разрушения рецепторов.

      При  постановке РГА используют те  эритроциты (птиц, животных, человека), с которыми гемагглютинирующие свойства данного вируса проявляются лучше (например, эритроциты кур). Задерживающее действие на РГА могут оказывать ингибиторы, содержащиеся в тканях, где размножался вирус, и других биологических субстратах. Для снятия ингибиторного действия вируссодержащие материалы прогревают, обрабатывают трипсином, ацетоном и др.

                                        2.2.1. Техника постановки РГА

      На плексигласовой  доске готовят двукратные возрастающие  разведения в объёме 0,5 мл исследуемого  вируссодержащего материала , начиная с 1:10 и до 1:1280. в луночки с разведениями добавляют равные объёмы 1% взвеси эритроцитов кур. Доску осторожно встряхивают и оставляют на 30-45 мин при комнатной температуре. Учёт результатов проводят по трёхкрестовой системе в зависимости от внешнего вида осадка эритроцитов. При гемагглютинации на «+++» осадок имеет форму зонтика и занимает всё дно лунки. При отсутствии агглютинации эритроциты оседают в центре лунки в виде компактного диска.

   Титром вируса  называется то наибольшее его  разведение, при котором ещё наблюдается выраженная гемагглютинация («+++» или «++»). В нашем примере титр вируса 1:320 (табл. 4). Количественное содержание вируса в разведении, равном титру, называется гемагглютинирующей единицей (содержится в 0,5 мл разведения 1:320). Определение этой величины необходимо для постановки РТГА, в которой в качестве рабочей дозы вируса берут 4 гемагглютинирующие единицы.   

                                                                                                      Таблица 4

       Схема  постановки реакции гемагглютинации  при диагностике гриппа

     Если предварительно  соединить вирус со специфической  иммунной вируснейтрализующей сывороткой  и потом добавить эритроциты, то такой инактивированный вирус  теряет способность вызывать  гемагглютинацию. Эта реакция получила название реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и может быть использована для окончательной идентификации неизвестного гемагглютинирующего вируса – по специфической диагностической сыворотке, а также для выявления титра неизвестных антител в сыворотке больного – по известным вирусным антигенам-диагностикумам.

      Затрудняет  применение РТГА наличие в  сыворотках крови человека и  животных неспецифических вирусных  ингибиторов, которые могут вызвать  неспецифическое торможение гемагглютинации. Выпускают противовирусные диагностические сыворотки, освобожденные от ингибиторов. РТГА ставят обычно на досках с лунками по методике, сходной с РГА.

                                         2.2.2. Техника постановки РТГА

         РТГА с целью идентификации вируса гриппа рода А. На плексигласовой доске готовят три ряда двукратных возрастающих разведений (в объёме 0,25 мл) диагностических противогриппозных сывороток А(Н1N1), А(Н2N2) и А(Н3N2) от 1:10 до 1:320 (до титра сывороток). Во все лунки, кроме контрольной, добавляют по 0,25 мл рабочей дозы вируса (разведение 1:40), в котором содержится 4 гемагглютинирующие единицы (табл. 5). После выдерживания реакции в течение 1 часа при комнатной температуре во все лунки добавляют по 0,5 мл 1% взвеси эритроцитов кур. Учёт результатов проводят через  30-40 минут. В примере торможение произошло  сывороткой  А(Н3N2), следовательно выделен вирус гриппа, принадлежащий к подтипу А(Н3N2).

                                                                                                     Таблица 5

           Схема постановки РТГА для  определения типовой принадлежности     

                                                 вируса гриппа А

     РТГА ставят  и для определения наличия  и титра антител в сыворотке  больного. Для этого готовят последовательные двукратные разведения сыворотки в объёме 0,25 мл и соединяют их с 0,25 мл известного антигена (содержащего 4 гемагглютинирующие единицы), чтобы произошла нейтрализация вируса. Затем в пробирки вносят по 0,5 мл взвеси эритроцитов. За титр сыворотки принимают то наибольшее её разведение, в котором ещё наблюдается торможение гемагглютинации (1:160).

                            2.2.3. Реакция нейтрализации вирусов in vivo

          Основными составляющими компонентами  этой реакции являются: иммунная вируснейтрализующая (опытная) и нормальная (контрольная) сыворотки одного и того же вида животного или человека; содержащий живые вирусы материал, являющийся антигеном; биологические объекты (мыши, куриные эмбрионы), на которых обнаруживают вируснейтрализующее действие иммунной сыворотки. Применяют два варианта постановки реакции нейтрализации. При одном из них берут постоянную дозу сыворотки и различные разведения вируса, при втором – постоянное разведение вируса и различные разведения сыворотки. Во всех случаях последовательность проведения реакции следующая:

1. предварительный контакт вируссодержащего материала с     соответствующей иммунной сывороткой (один из этих компонентов заведомо известен, наличие другого определяется);
2. введение этой смеси в чувствительную биологическую систему (белым мышам или куриным эмбрионам);
3. учёт наличия или отсутствия нейтрализации.

     Сыворотки  получают либо от больных людей,  либо применяют диагностические  сыворотки от иммунизированных  животных. Перед постановкой реакции  сыворотки инактивируют, прогревая при температуре 56-60⁰С.

      Антигены (вируссодержащие взвеси) получают  из материала от больных вирусными  инфекциями, готовят из органов  и тканей заражённых вирусом  животных, куриных эмбрионов, а  также из инфицированных клеточных культур и подвергают очистке. Перед употреблением антиген титруют для определения его активности.

      Биологические  объекты выбирают с учётом  свойств вируса, чувствительности  самого объекта к действию  вируса, а также задач и условий  исследования.

                               Постановка реакции нейтрализации (I вариант)

       Ставят для идентификации выделенного вируса. Для постановки реакции берут два ряда пробирок, из которых первый ряд является опытным, а второй – контрольным. В первый ряд пробирок наливают определённое количество неразведённой диагностической иммунной сыворотки, во второй – контрольный – такое же количество неразведённой нормальной сыворотки того же вида животного. Отдельно в пробирках готовят несколько разведений вируса, чтобы при добавлении их в пробирки опытного, контрольного ряда получились последовательные 10-кратные разведения вируса (например, 10^-1, 10^-2, 10^-3 и т.д.). Сыворотки и добавляемые разведения вируса должны быть в одинаковых объёмах, например по 0,2 мл. Пробирки с приготовленной смесью ставят в термостат при температуре 37⁰С обычно на 1-2 часа. После этого опытные и контрольные смеси вводят мышам или в куриные эмбрионы. Каждым разведением для достоверности опыта заражают не менее 4 мышей или куриных эмбрионов.