Окраска микроорганизмов

Окраска микроорганизмов  — наиболее распространенный в микробиологии комплекс методов и приемов, применяемый для обнаружения и идентификации микроорганизмов с помощью микроскопа. В естественном состоянии бактерии имеют такой же коэффициент преломления, как и стекло, поэтому они невидимы при микроскопическом исследовании. Окрашенные клетки наоборот четко видны. Кроме того, болезнетворные микроорганизмы в процессе обработки инактивируются, что делает препарат безопасным для исследователя. Окраска микроорганизмов позволяет изучить морфологические особенности микробов, а иногда точно определить их вид, например некоторые микробы — одинаковые по морфологии — различно окрашиваются с помощью одних и тех же сложных методов окраски. Окраска микроорганизмов представляет собой физико-химический процесс соединения химических компонентов клетки с краской. Отношение к различным красителям и методам окраски называют тинкториальными свойствами микроорганизмов. В ряде случаев различные части микробной клетки (ядро, цитоплазма) избирательно окрашиваются различными красителями. Наиболее пригодными для окраски микроорганизмов являются анилиновые красители, которые дифференцируют на основные и кислые. У основных красителей ионом, придающим бактериальной клетке окраску, служит катион, у кислых - анион, а структуры бактерий, взаимодействующие с красителем, преимущественно отрицательно заряжены и поэтому лучше воспринимают основные красители.

Бактериологические  красители:

1. Основные красители : красные (нейтральный красный,  пиронин, сафранин, основной фуксин); фиолетовые (генциан фиолетовый, кристаллический фиолетовый, гематоксилин, тионин); синие (виктория, метиленовый синий); зелёные (малахитовый зелёный, метиленовый зелёный, янус зелёный); коричневые (везувин, хризоидин); чёрные (индулин).
2. Кислые красители : розовые и красные (кислый фуксин, эозин, эритрозин, гропеолин); жёлтые (аурантил, конго, пикриновая кислота); чёрные (нигрозин).
3. Спиртовые растворы : карболовый фуксин Циля; фуксин Пфейффера; карболовый кристаллический фиолетовый; щелочной метиленовый синий Леффлера.
4. Водные растворы : раствор сафранина; раствор малахитового (бриллиантового) зелёного; раствор Люголя.

 

Приготовление окрашенного препарата включает ряд этапов:

1. приготовление мазка;
2. высушивание мазка;
3. фиксацию мазка;
4. окраску;
5. высушивание.

Мазок готовят на чистых предметных стеклах, на середину которых наносят небольшую каплю воды и в нее с помощью бактериологической петли помещают исследуемый материал. Материал распределяют на стекле равномерным тонким слоем, размер мазка —1—2 см2. 
Препарат обычно высушивают при комнатной температуре на воздухе. Для ускорения высушивания допускается подогревание мазка в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки. 
Высушенный мазок подвергается фиксации, при которой мазок прикрепляется к стеклу (фиксируется), а микробы становятся более восприимчивыми к окраске. Способов фиксации много. Наиболее простой и распространенный физический — фиксация жаром — нагревание на пламени горелки (препарат проводят несколько раз через наиболее горячую часть пламени горелки). В ряде случаев прибегают к фиксации жидкостями (этиловый или метиловый спирт, ацетон, смесь равных объемов спирта и эфира — по Никифорову) - химический способ. После фиксации мазок окрашивают. Количество краски, наносимое на препарат, должно быть таким, чтобы покрыть всю поверхность мазка. По истечении срока окрашивания (2—5 мин.) краску дистиллированной водой, препарат подсушивают фильтровальной бумагой или на воздухе и микроскопируют.

Существуют простые, сложные  и дифференциальные способы окрашивания микробов. При простой окраске обычно употребляют одну краску, чаще всего красную — фуксин, или синюю — метиленовый синий. Фуксин красит быстрее (1—2 мин.), метиленовый синий — медленнее (3—5 мин.). Фуксин приготовляют в виде концентрированного карболового раствора (фуксин Циля), очень стойкого и пригодного для окраски в течение многих месяцев. Метиленовый синий приготовляется заранее в насыщенном спиртовом растворе, который стоек и может долго храниться. 
Сложные способы окраски, при которых применяются два или более красителя, являются ценными методами, используемыми в микробиологической диагностике инфекционных болезней. 
Наибольшее практическое значение имеет окраска по методу Грама и окраска по методу Циля-Нильсена.

 

СЛОЖНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ  БАКТЕРИЙ.

Окраска по методу Грама:

1. На фиксированный на огне мазок помещают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной спиртовым раствором генциан-, метил- или кристаллвиолета (бумажки по Синеву), наносят на неё несколько капель дистиллированной воды для увлажнения, выдерживают 1-2 мин., бумажку удаляют.
2. Препарат, не промывая, обрабатывают раствором Люголя на 1-2 мин. Мазок приобретает серо-бурую окраску.
3. Сливают раствор Люголя.
4. Для обесцвечивания вносят несколько капель 96%-ного этанола на 1-2 мин.; следят, чтобы он равномерно распределился по поверхности всего мазка.
5. Препарат тщательно промывают водой.
6. Докрашивают фуксином Пфейффера 1-2 мин.
7. Бумажку снимают, препарат промывают водой.
8. Промывают водой, высушивают, микроскопируют.

Результат окраски: грамположительные бактерии окрашиваются основной краской в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные бактерии, воспринимая дополнительную окраску, приобретают ярко-малиновый цвет.

Основная сложность  окраски по методу Грама - опасность  переобесцвечивания препарата этанолом.

Окраска по методу Циля-Нильсена:

1. Фиксированный на пламени горелки мазок окрашивают в течение 3 – 5 мин. раствором карболового фуксина Циля или окрашенной фуксином бумажкой с подогреванием до появления паров, но не доводя краситель до кипения.
2. Дают препарату остыть, бумажку снимают, сливают избыток красителя, препарат промывают водой.
3. Окрашенный препарат обесцвечивают 5%-ным раствором серной кислоты в течение 3 – 5 с или 96° этиловым спиртом, содержащим 3% по объему хлористоводородной кислоты, несколько раз погружая стекло с мазком в стаканчик с солянокислым спиртом.
4. После обесцвечивания остаток кислоты сливают и тщательно промывают препарат водой.
5. Докрашивают дополнительно метиленовым синим Леффлера 3 – 5 мин.
6. Окрашенный препарат промывают водой, подсушивают и микроскопируют.

1. На фиксированный  мазок накладывают белую фильтровальную  бумагу и наливают карболовый фуксин Циля. Препарат 2-3 раза подогревают в в пламени до появления паров.	Карболовый фуксин-основная краска; прогревание-протрава.
2. Препарат промывают  водой, бумагу сбрасывают.
3. Препарат обесцвечивают  в 5% растворе серной кислоты.	Серная кислота-обесцвечивающий фактор.
4. Промывают водой
5. Докрашивают синькой Леффлера 3-5 минут	Синька Леффлера —  дополнительная краска
6. Промывают водой,  высушивают, смотрят под иммерсией	Кислотоустойчивые бактерии и споры рубиново- красного цвета, а остальная микрофлора — синего цвета

 

Метод окраски по Цилю является основным для окраски кислотоустойчивых  бактерий, которые при окраске  препаратов окрашиваются фуксином в  рубиново-красный цвет и не обесцвечиваются  кислотой. Некислотоустойчивые бактерии, а также элементы ткани и лейкоциты под действием кислоты обесцвечиваются и приобретают цвет дополнительного красителя (синий).

 

МЕТОДЫ ОКРАСКИ БАКТЕРИЙ С ЦЕЛЬЮ ВЫЯВЛЕНИЯ СПОР, КАПСУЛ, ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ ВКЛЮЧЕНИЙ.

 

Спора - особая форма существования  грамположительных бактерий. Споры с большим трудом воспринимают красители, но прочно удерживают их после окраски. На этой особенности спор основаны все методы их выявления.

 

Окраска по методу Мёллера:

1. Фиксированные мазки помещают на 2 мин. в хлороформ.

2. Переносят в 5 % водный  раствор хромовой кислоты на 2 — 10 мин.

3. Промывают в проточной  воде и окрашивают карболовым  фуксином 1 мин (стекло при этом  подогревают на горелке до  появления паров).

4. Дифференцируют в 5 % серной кислоте 5 с.

5. Хорошо промывают в проточной воде и подкрашивают водным   раствором метиленового синего 3 мин.

6. Промывают в проточной  воде, сушат и изучают при иммерсии.

Результат: споры окрашиваются в розово-красный цвет, вегетативные клетки — в синий.

Окраска по методу Пешкова для выявления спор:

1. Фиксированный мазок окрашивают метиленовым синим с подогреванием до закипания.

2. Препарат промывают водой.
3. Докрашивают 1%-ным водным раствором нейтральрота в течение 10 с.
4. Препарат промывают водой и высушивают.

Результат: споры синие, вегетативные клетки красные.

Окраска по методу Вальдмана:

1. На фиксированный мазок наносят щелочную синьку Леффлера и нагревают до кипения.
2. Дают остыть и промывают водой.
3. Докрашивают 1%-ным раствором нейтрарольта 30 с.
4. Промывают водой и просушивают.

Результат: споры синие, вегетативные клетки красные.

Окраска по методу Ауески:

1. Нефиксированный мазок обрабатывают 0,5%-ным раствором соляной кислоты 2-3 мин. при подогревании.
2. Промывают водой и фиксируют над пламенем.
3. Окрашивают карболовым фуксином Циля при подогревании 7-8 мин.
4. Краску сливают и препарат обрабатывают 5%-ным раствором серной кислоты 5-7 мин.
5. Промывают водой и докрашивают метиленовым синим 4-5 мин.
6. Вновь промывают водой и подсушивают.

Результат: споры красные, вегетативные клетки синие.

Окраска по методу Шеффера-Фултона:

1. Фиксированный мазок покрывают фильтровальной бумагой.
2. Наливают 0,5%-ный водный раствор малахитовой зелени и выдерживают 5 мин. над кипящей водой.
3. Промывают водой и окрашивают 2%-ным водным раствором сафранина 30 с.
4. Препарат промывают водой, подсушивают.

Капсула - это слизистое  образование, обволакивающее летку  и сохраняющее связь с клеточной стенкой. Вещество капсулы обычно воспринимает красители слабее, чем другие клеточные компоненты, поэтому при специальных методах окраски можно дифференцировать капсулу от остальных структур.

Окраска по методу Романовского-Гимза

1. Препарат, фиксированный в этаноле или жидкости Никифорова, кладут мазком вниз в чашку Петри с подставками.
2. Под препарат наливают краску Романовского-Гимзы (15-20 капель на 10 мл дистиллированной воды).
3. Выдерживают 15-20 минут.
4. Препарат промывают водой, подсушивают.

Краска Романовского-Гимза  состоит из смеси азура, эозина и  метиленовой сини. Она окрашивает протоплазму форменных элементов ткани в голубовато-синий цвет, а ядра клеток, также как и микробные тела, в фиолетово-красный.

Окраска по методу Нейссера для выявления зерен волютина

1. Фиксированный на пламени горелки мазок окрашивают 1 – 2 мин. синькой Нейссера.
2. Синьку сливают, на препарат наносят несколько капель раствора Люголя на 1 мин.
3. Мазок промывают водой, подсушивают фильтровальной бумагой.
4. Докрашивают в течение 2 мин. раствором хризоидина или 1 – 3 мин. раствором везувина.
5. Промывают водой, подсушивают и микроскопируют.

Зерна волютина окрашиваются в синий цвет, тела микробных клеток – в светло-коричневый цвет.

Окраска по методу Пешкова для выявления спор

1. На фиксированный мазок наливают синьку Леффлера и дают краске закипеть. Окрашивание мазка происходит кипящей синькой в течение 20 – 30 с.
2. Препарат промывают водой.
3. Докрашивают 0,5%-ным водным раствором нейтральрота в течение 30 – 60 с.
4. Промывают водой и высушивают.