Питательные среды, используемые при микробиологических исследованиях

 

 

 

 

 

Питательные среды, используемые при микробиологических  исследованиях

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                                                                                Выполнили:

                                                                                                              

 

 

 

 

 

 

 

 

Содержание

1. Введение
2. Питательные среды
1. Для определения общего микробного числа микроорганизмов
2. Для обнаружения стафилококков
3. Для обнаружения бактерий группы кишечных палочек
4. Для обнаружения энтерококков
5. Для обнаружения патогенных энтеробактерий
6. Для обнаружения иерсиний
7. Для контроля стерильности
3. Список литературы

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

Питательная (-ые) среда — это искусственный субстрат, представляющий собой сбалансированную смесь питательных веществ в концентрациях и сочетаниях, необходимых для роста и деления микро­организмов или клеток высших организмов.

Синтетические питательные среды состоят из определённых наборов органических и неорганических соединений, которые служат источниками углерода, азота, фосфора, серы, калия, натрия, микроэлементов и др. необходимых компонентов. К сложным органическим питательным средам относятся мясопептонный бульон, пивное сусло, молоко и др. Из жидкой питательной среды можно получить плотную, добавляя к ней 2% агар-агара или 10% желатины. В качестве плотных питательных сред применяют также кусочки картофеля или моркови, зёрна риса или пшена, свёрнутую лошадиную сыворотку, кусочки внутренних органов животных и т.п. Все питательные среды предварительно стерилизуют в автоклаве. Ранее полагали, что некоторые болезнетворные бактерии могут расти только на питательных средах с кровью, сывороткой, асцитической жидкостью и т.п. Однако изучение патогенных микробов показало, что большинство из них может расти на синтетической питательной среды с глюкозой и сернокислым аммонием (в качестве источников углерода и азота), содержащих вместе с тем необходимые витамины, аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, микроэлементы и др. Некоторые непатогенные и патогенные микроорганизмы (например, возбудитель сифилиса Treponema pallidum) пока не удаётся выращивать на искусственных питательных средах.

Наряду с универсальными питательными средами существуют специальные питательные среды, создающие более благоприятные условия для роста определённого вида микроорганизмов. Такие питательные среды называются элективными. Добавляя вещества, понижающие окислительно-восстановительный потенциал, получают среды, на которых растут анаэробные микроорганизмы. Элективные питательные среды определённого состава употребляют для выяснения ряда физиологических свойств микроорганизмов. Так, на средах, не содержащих соединений азота, выделяют азотфиксирующие микроорганизмы. На жидкой питательной среде, в состав которой входят нитраты и индикатор, изменяющий цвет при подщелачивании среды, т. е. сдвиге pH, определяют способность микроорганизма восстанавливать нитраты. Жидкие питательные среды, содержащие различные углеводы или спирты, а также индикатор, изменяющий окраску при подкислении, наливают в пробирки, на дне которых находятся маленькие, перевёрнутые вверх дном пробирки. При подкислении среды микроорганизмами индикатор изменяет цвет, а образующийся газ скапливается в погруженной в среду маленькой пробирке. Рост на мясопептонной желатине может сопровождаться её разжижением, что говорит о биосинтезе протеолитических ферментов. Посевами на кровяной агар устанавливают гемолитические свойства микроорганизма. С помощью посевов на картофельный агар и последующей обработки выросших колоний или штрихов растворами, содержащими йод, выясняют способность микробов гидролизовать крахмал, так как исчезает синяя окраска крахмала от йода. Существуют дифференциально-диагностические питательные среды, применяемые для определения патогенных видов микроорганизмов.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Питательные среды:

1. Для определения общего микробного числа микроорганизмов используется: 

• 1% пептонную воду

• мясопептонный бульон (МПБ).

2. Для обнаружения стафилококков используется:

• молочно-солевой агар: к 1 л мясопептонного бульона добавляют 65 г хлорида натрия и 20 г сухого агар-агар. Разливают по колбам и стерилизуют при 120°С 20 мин. Перед посевом к расплавленному и охлажденному до 45°С агару добавляют 10% стерильного молока, равномерно смешивают и разливают в чашки Петри.
• желточно-солевой агар Чистоковича. 100 мл желточной эмульсии (один желток, размешанный в 200 мл изотонического раствора хлорида натрия) вливают в 300 мл расплавленного и охлажденного до 50°С мясопептонного и разливают в стерильные чашки Петри.
• молочно-желточно-солевой агар. В 1 л дистиллированной воды растворяют при нагревании сухой питательный агар в количестве, указанном на этикетке банки, и 90 г хлорида натрия; разливают в колбы, стерилизуют при 120°С 20 мин. Перед употреблением в расплавленный и остуженный до 50°С агар добавляют 60мл стерильного молока, один желток (тщательно разбитый стеклянными бусами с 50 мл изотонического раствора хлорида натрия), полимиксин М 300 000 ЕД. Среду перемешивают и разливают в чашки: по 20-25 мл для использование при подращивании стафилококков на мебрананных фильтрах и по 12-15 мл (тонким слоем) для прямого посева.

3. Для обнаружения бактерий группы кишечных палочек:

• используется глюкозопептонную воду (ГПС), среда Эйкмана. Концентрированная среда: в 1 л воды растворяют 100 г пептона, 50 г хлорида натрия, 50 г глюкоза, нагревают смесь до кипения, фильтруют, устанавливают рН 7,4-7,6, разливают по 10 мл в колбы (емкостью по 100-250 мл) с поплавками и по 1 мл в пробирки с поплавками. В среду можно добавить индикатор Аедреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью) или бромтимоловый синий. Разведенную среду глюкозопептонной воды готовят так же, как концентрированную, но количество ингредиенов в 10 раз меньше на 1 л воды.
• Лактозо-пептонную среду готовят так же как ГПС, с заменой глюкозы на лактозу. Среды стерилизуют при 112°С 12 мин.
• среду Эндо. Среду готовят из сухого порошка по прописи, указанной на этикетке банки. Состав порошка: сухой мясо-пептонный агар, лактоза, основной фуксин, сульфит натрия. Среду готовят в день ее использования. Горячую среду различают в стерильные чашки Петри и оставляют до застывания на поверхности стола. Хранить чашки со средой можно не более 3 дней в темном месте или в холодильнике.
• Среду Эндо с молоком ( по Г. П. Калине). Среду готовят из сухого порошка, но воды берется меньше: к 90 мл среды добавляют 10 мл стерильного молока, 0,2 мл 10% спиртового раствора основного фуксина, 0,2 мл 5% спиртового раствора розоловой кислоты, тщательно перемешают зоны просветления при выпадении в осадок параказена.
• желточно-лактозный бульон с бриллиантовым зеленым. К 700 мл дистиллированной воды добавляют 10 г пептона, 10 г лактозы, 200 мл желчи, 13,3 мл 1% водного раствора бриллиантового зеленого и доливают по 5 мл в пробирки с поплавками, стерилизуют при 112°С 12 мин.
• среду ФКП-1. Среду готовят так же, как желточнолактозный бульон, но только лактозы берут 1 г и добовляют 1 г триптофана.
• среду Хейфеца. В 1 л воды растворяют при нагревании 10 г пептона, 5 г хлорида натрия, 5 г маннита. Устанавливают рН 7,4-7,6, фильтруют и добавляют 10 мл 5% спиртового раствора розоловой кислоты, 23 мл 0,1% влного раствора метиленового синего. Стерилизуют при 100°С (текучим паром) 20 мин. Зазливают в стерильные пробирки и скашивает со столбиком. Цвет среды краснофиолетовый.
• среду Кесслера. К 1 л воды добавляют 10 г пептонна, 50 мл желчи, кипятят 20-30 мин, добавляют 2,5 г лактозы, доводят объем до 1 л, устанавливают рН 7,8-8,2 и добавляют 4 мл 1% водного раствора генциального фиолетового. Среди разливают в пробирки с поплавками и стерилизуют при 0,5 атм. 15 мин. Среда фиолетового цвета. Среда применяется при исследовании почвы.
• лактозный бульон с борной кислотой

4. Для обнаружения энтерококков используется:

щелочно-полимиксиновая среда. Приготавливают три раствора по следующим рецептам :

• Раздельно стерилизуют растворы 1, 2 и 3 при 112°С 12 мин. Растворы смешивается, устанавливают рН 10,0-10,2, добавляют полимиксин, бромтимоловый синий, разливают по 10, 50 и 100 мл во флаконаы (удвоенной концентрации).
• молочно-ингибиторная среда Калины. К 85 мл стерильного питательного агара добавляют 15 мл стерильного молока, 1,25 мл 0,01% водного раствора кристаллического фиолетового. Перемешивают и разливают по стерильным чашкам Петри.
• желчная среда, среда Турчинского. К 600 мл дистиллированной воды добавляют 400 мл желчи, 35-40 г сухого питательного агара, по 5 г фосфата калия однозамещенного си двузамещенного, 5 г натрий-аммония фосфата. Расплавляют при нагревании, разливают по флакон и стерилизуют при 120°С 20 мин. Перед употреблением в расплавленный остуженный агар добавляют на каждые 100 мл среды 0,5 г глюкозы, 1 мл 1% водного раствора TTX, 0,6 мл 1% водного раствора синего, 20000 ЕД полимиксина М, 1-2 мл 0,1% спиртового раствора фурацилина. Разливают по 20 мл в чашки Петри (толстым слоем).
• каждые 100 мл среды 0,5 г глюкозы, 1 мл 1% водного раствора TTX, 0,6 мл 1% водного раствора синего, 20000 ЕД полимиксина М, 1-2 мл 0,1% спиртового раствора фурацилина. Разливают по 20 мл в чашки Петри (толстым слоем).

5. Для обнаружения патогенных энтеробактерий используется:

• селенитовый бульон. Бульон готовят из сухой среды Луйфсона по прописи на этикетке. При необходимости ее можно приготовить следующим образом. Основной раствол: в 1 л воды растворяют 7 г фосфата натрия двуузамещенного безводного, 3 г фосфата натрия однозамещенного, 5 г пептона и 4 г лактозы. Устанавливают рН не выше 7,0. Стерилизуют при 112°С 30 мин. Перед началом работы 2 мл 10 % раствора стерильного кислого селенистокислого натрия. Готовую среду разливают в стерильные пробирки по 5-7 мл.
• тетратионатный бульон Мюллера. К 90 мл стерильного мясопептонного бульона добавляют 4,5 г стерильного мела, 2 мл раствора Люголя, 10 мл гипосульфата натрия. ( При приготовлении раствора Люголя к 20 мл дистиллированной воды добавить йодида калия 20 г, йода 25 г, а за тем долить до 100 мл воды). Среда предназначена для накопления в материале сальмонелл.
• тетратионатная среда с бриллиантовым зеленым (среда Кауфмана). К 500 мл тетратионатной среды добавляют 25мл стерильрой жклчи и 5 мл 0,1%раствора бриллиантого зеленого. Среда служит для накопления сальмонелл.
• трехсахарный агар с мочевиной по Олькеницкому. Среда является дифференциально-диагностической. К 100 мл дистиллированной воды добавляют 2,5 г сухого питательного агара, 1 г лактозы, 1 г сахарозы, 0,1 г глюкозы, 1 г мочевины, 0,02 соли Мола, 0,03 г тиосульфата натрия, 0,4 мл 0,4% водного раствора фенолового красного. Все тщательно перемешивают, устанавливают рН 7,2-7,4, разливают по пробиркам, стерилизуют текучим паром по 20 мин 3 дня подряд. Среду скашивают, оставляя столбик высотой 5 см. Среда после стерилизации бледно-розового цвета.
• среда Ресселя. К 100 мл 1,5 %мясопептонного агара добавляют 1 %лактозы, 0,1% глюкозы и 1 мл индикатора Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный едким натром) или смесь водного голубого и розоловой кислоты. Устанавливают рН 7,2. Среду разливают в пробирки, стерилизуют при 112°С 20 мин и скашивают, оставляя столбик агара высотой 2-3 см.

6. Для обнаружения иерсиний используется

• буферная среда обогащения. Предварительно готовят растворы солей: 3 мл 1/15 М гидрофосфата натрия в 100 мл дистиллированной воды и 7 мл 1/15 М дигидрофосфата натрия, также в 100 мл. Затем добавляют 8,5 г хлорида натрия, доводят общий объем воды до 1 л, фильтруют, устанавливают рН 7,2, разливают в пробирки по 5-6 мл и стерилизуют текучим паром 30 мин.

7. Среды для контроля стерильности:

• сахарный бульон Хоттингера. К мясному перевару Хоттингера (140-160 мг % амминного азота) добавляют 0,5% хлорида натрия, подщелачивают до рН 8-8,2 ( с помощью 10 % раствора едкого натра), кипятят 10 мин и фильтруют через ватный фильтр. Затем в среду вносят 1 % глюкозы, устанавливают рН 7,3-7,5, (с помощью 5 % хлористоводородной кислоты), фильтруют через бумажный фильтр и разливают в стерильные колбы или пробирки. Стерилизация при 120° С 30 мин.
• бульон Сабуро. В 1 л дистиллированной воды добавляют 10 г пептона, кипятят 10 мин и фильтруют через бумажный фильт. Затем добавляют 4% глюкозы (или мальтозы), устанавливают рН 5,7 разливают в стерильные колбы и пробирки. стерилизация при 112° С 30 мин.
• тиогликолевая среда. К 1 л дистиллированной воды добавляют 15 г гидролизата казеина, 5 г дрожжевого экстракта, 2,5 г хлорида натрия, 0,75 г цистина, 0,75 г агар-агара. Цистина предварительно растворяют в небольшом количества воды (с помощью едкого натра). Устанавливают рН смеси всех компонентов до 8-8,2, кипятят 5-10 мин до полного расплавления агара. Затем добавляют 5 г глюкозы и 0,3 мл тиогликолевой кислоты. Среду фильтруют, устанавливают рН 7,2-7,3 вносят 1 мл раствора резазурина натрия 1:1000, перемешивают и разливают в стерильные пробирки. стерилизация при 120° С 20 мин.

 

 

 

Список литературы:

 

1. Дезинфекционное дело. / Гандельсман Берта Израиловна. – Под ред. И.  И.

Карон. – М.: Медицина, 1971

2. Медицинская микробиология / Под ред. акад. РАМН В.И. Покровского. – М.:

ГЭОТАР-МЕД, 2001. – стр.543-547

3. Медицинская микробиология. / Гл. ред. В.И. Покровсктй, О. К. Поздеев  –

М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1998. – стр. 631-656

4. "Медицинская энциклопедия" РАМН 2001 Russ Portal Company Ltd.
5. Санитарная микробиология  и  вирусология./  З.  Н.  Качемасова,  С.  А.

Ефремова, А. М. Рыбакова – М.: Медицина, 1987. – 352 с.