Состояние антиоксидантной системы инфицированных грибом Heterobasidion annosum (Fr.) Bref проростков Pinus sylvestris L.

     АФК участвуют в процессе старения листьев и цветков,  связанного с              активной программой клеточной смерти –  апоптозом.  Эта программа               направлена на избирательное разрушение клеток. Программируемая клеточная смерть связана с активацией ферментов,  избирательно разрушающих                  клеточные структуры и белки. АФК участвуют в регуляции апоптоза,  так как влияют на его развитие и протекание. Повышение уровня АФК наблюдается вомногих случаях гибели клеток,  когда она явно детерминирована,  например,  в реакции сверхчувствительности и при старении [28].

 

1.5.Перекисное окисление липидов — одна из возможных компонент быстрой реакции на стресс

Все живые организмы разными  способами реагируют на изменения              окружающей среды.  Формирование защитных эффектов адаптации             обеспечивается активацией генетического аппарата,  изменением метаболизма клетки,  а также изменением функционирования практически всех основных систем организма.  Любые сильные воздействия окружающей среды вызывают стандартную стресс-реакцию.  При кратковременном действии стрессов              умеренной интенсивности происходит усиление функционирования органов и мобилизация организма. Однако, при интенсивной или длительной                   стресс-реакции в клетках происходит активация процесса                                         свободно-радикального окисления,  внутриклеточная кальциевая перегрузка,  угнетение энергопродукции,  снижение синтеза белка и денатурация белковых структур. Это оказывает повреждающее воздействие на органы, ткани, и, таким образом стресс-реакция из звена адаптации превратится в звено патогенеза. Однако, активации стресс-систем и реализации повреждающих эффектов               препятствуют стресс-лимитирующие системы.

Одним из возможных компонентов  быстрой реакции на стресс является активация перекисного окисления  липидов (ПОЛ). Известно, что в нормальных условиях жизнедеятельности клетки постоянно присутствует определенный уровень перекисного окисления липидов, индуцированный образованием                активных форм кислорода [21]. Перекисное окисление липидов в клетке                поддерживается на постоянном уровне благодаря многоуровневой                            антиоксидантной системе защиты. Таким образом, сбалансированность между обеими частями этой системы –  перекисным окислением с одной стороны и антиоксидантной активностью с другой является необходимым условием для поддержания нормальной жизнедеятельности клетки.

Учитывая необходимость  сохранения прооксидантно  -антиоксидантного равновесия в стационарном режиме, можно предположить, что его смещение является одним из первых неспецифических звеньев в развитии стресс- реакции и может служить,  согласно Барабою,  тем биологически важным изменением внутренней среды клетки,  которое запускает другие механизмы защиты.            Продукты ПОЛ могут являться как индукторами, так и первичными                        медиаторами стресса как особого состояния клетки, который может привести к повышению её резистентности. В клетках растений наиболее интенсивно                               образование активных форм кислорода происходит на сопрягающих мембранах хлоропластов и митохондрий [23,18].

Антиоксиданты липидной фазы представлены двумя основными классами низкомолекулярных соединений. К  первому относят фенольные токоферолы и близкие к ним по строению убихиноны и витамин К, обладающие комплексной антирадикальной активностью [17]. Главным действующим началом,                      обеспечивающим способность фенольных антиоксидантов тормозить                   радикальные процессы окисления, является гидроксильная группа, присоединенная к ароматическому ядру. Эти соединения в основном перехватывают               перекисные и алкоксильные радикалы, но могут ингибировать также О₂^·-, НО^2·, ¹О², ОН^· [19].

Взаимодействие фенольных  антиоксидантов с органическими радикалами               приводит к образованию феноксильных радикалов, которые в дальнейшем                могут участвовать в реакциях диспропорционирования с образованием                   хинолидных перекисей. Распад хинолидных перекисей приводит к образованию хинонных форм молекул, которые не обладают антиоксидантными свойствами и восстанавливаются с помощью других антиоксидантов, в частности,                     аскорбата. Фенольные антиоксиданты также участвуют в ингибировании или инактивации ферментов, активирующих кислород. Механизмы этих процессов могут быть основаны на конкуренции фенолов с субстратом при связывании с регуляторным центром фермента, или инактивации активного центра.

Огромное количество фенолов, особенно флавоноиды, ингибирует              простагландинсинтазу, липоксигеназу, миелопероксидазу, НАД(Ф)Н-оксидазу и ксантиноксидазу  [15].

Локализующийся в мембранах  α-токоферол (витамин Е) вызывает обрыв цепей свободнорадикального окисления путем взаимодействия с пероксильными и алкоксильными радикалами с образованием токофероксильного радикала,               который восстанавливается или вступает в реакцию с новыми пероксильными радикалами. При этом образуется большое число молекулярных продуктов с эпокси-, кето-, гидроперокси- и другими группами. Таким образом, токоферол нейтрализует свободные радикалы мемранных липидов, перехватывая и               устраняя их. Токоферол взаимодействует с О^2·-, ¹О². Кроме того, токоферолы снижают проницаемость мембран, а также связывают свободные жирные              кислоты, избыток которых дестабилизирует мембранную структуру.

Второй класс липорастворимых антиоксидантов – ретинол, его                            предшественники и производные [17].

Антиоксидантная роль каротиноидов проявляется в основном в                     ингибировании синглетного кислорода, но они могут обезвреживать и                                  пероксирадикалы [9]. Наилучшим эффектом обладают (β-каротин и ликопин, способные хелатировать ионы Fе2+. Показано, что каротиноиды тушат ¹О² главным образом по физическому механизму [10]. Антиокислительная функция этих веществ состоит также в том, что они – тушители триплетного состояния хлорофилла, являющегося одним из источников образования ¹О² [18].

Скорость ПОЛ существенно  зависит от структурной организации                 фосфо-липидов мембран: чем плотнее их упаковка, тем меньше скорость              окисления. Способностью стабилизировать липиды мембран обладают                   токоферолы, вита мин К, убихиноны, каротиноиды, холестерол, другие                    стерины. Встраиваясь боковыми цепями между НЖК мембран, эти вещества образуют комплексы с их двойными связями. К структурным АО относят и другие соединения [13].

В настоящее время происходит активный поиск новых антиоксидантов, природных и синтетических. Обнаружены АО-свойства низкомолекулярных стероидов  – витамина Д₃ и экдистерона, моносахаридов,некоторых дипептидов – карнозина, карцинина, и др. Они способны непосредственно                               взаимодействовать с активными радикалами, восстанавливать гидроперекиси, хелатировать металлы переменной валентности [16].

Отличительной особенностью большинства эндогенных                                    низкомолекулярных антиоксидантов является нелинейная зависимость между их концентрацией и степенью ингибирования свободнорадикальных процессов [17,18,19] .Нерегулируемое увеличение содержания веществ с выраженными антиоксидантными свойствами в определенных условиях может привести к              активации побочных реакций с образованием прооксидантов и АФК                  (прооксидантный эффект). Так, из аскорбиновой кислоты и глутатиона при окислении и автоокислении образуются промежуточные радикальные формы, в реакциях обмена которых возможно образование пероксида водорода и других АФК. Кроме того, прооксидантная функция может быть связана с                           восстановлением этими веществами ионов Fе2+, Сu+ [17,18]

 

 

 

 

 

 

2.ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1.Объект исследования

Объектами исследования были проростки сосны обыкновенной Pinus sylvestris, полученные с семян темного и светлого цвета. В исследовании            использовали семена Pinus sylvestris L. – сосны обыкновенной, которая                 произрастает в Луганской области, Станично Луганское ЛОХ  Кондращевского лесничества. Отдельно изучали реакцию проростков P.sylvestris , полученных из семян темного и светлого цвета при инфицировании штаммами H.annosum. К группе семян P.sylvestris светлого цвета отобрали семена следующих цветов: plumbeus (свинцовый), cinereus griseus (пепельно - серый), avallaneus             (ореховый); к группе семян P.sylvestris темного цвета – brunneus                           (темно – каштанновый, бурый), umbrinus (умбриновый), niger (черный).

Штаммы H.annosum взяты из коллекции кафедры физиологии растений.

 

2.2.Методы исследования

Стерилизацию семян P.sylvestris проводили следующим образом:  семена сосны промывали под проточной водой в течении 1 - 1,5 часа, потом погружали в 15% раствор перекиси водорода на 20 - 30 минут. После этого высаживали семена в большие пробирки размером 20×200 мл  на агазированную                       питательную среду Чапека-Дока следующего состава (г/л): глюкоза-3, NaNO₃-2,KH₂ PO₄ -  1, MgSO₄*7H₂O – 0,5, KCl – 0,1, FeSO₄*7H₂O – от печатки, Агар – агар – 10,  приготовленную среду разливали в пробирки по 5-7 мл, и                      стерилизовали в автоклаве АГ-1 при давлении 0,8 - 1 атмосфер, в течении 40 минут. На 21 день роста молодые проростки инокулировали мицелием                штаммов НЦСГ и На-6-96 H.annosum. Содержание перекиси водорода и                 перекисное окисление липидов в проростках P.sylvestris определяли на 4,7 и 10             сутки после инфицирования, для сравнения использовали неинфицированные растения.

 

 

2.2.1. Метод определения перекисного окисления липидов

Навеску растительного материала 0,1 г гомогенизируют в 2 мл среде              выделения (0,1 М трис – HCl  буфер рН 6,7, который содержит 0,35 М NaCl ). Гомогенат сливают в пробирку, 1 мл буфера смывают ступку, общий объём – 3мл.

В опытную  пробирку к 3 мл гомогената добавляют 1 мл 0,67% - ный      раствор ТБК и 2 мл 20% - ный раствор ТХУ.

В контрольную пробирку  (проба на реактивы): к 3 мл буфера добавляют 1 мл 0,67% - ный раствор ТБК и 2 мл 20%- ный раствор ТХУ.

Ставят на водяную баню 100^оС с обратным охлаждением 30 минут.             Центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин. Регистрируют оптическую            плотность по длине волны 532 нм против контроля.

Концентрацию МДА рассчитывают по коэффициенту экстенции по              формуле:

С=

C-  концентрация МДА, мкМоль;

D-оптическая плотность

ε – коэффициент молярной екстенции (1,56 ×10 ^-5 см ^-1М^-1);

l – толщина шара раствора в кювете (1см)

Количество МДА пересчитывали на 1г массы сырого вещества.

 

2.2.2.Принцип метода  определения содержания пероксида  водорода

Содержимое пероксида  водорода в инфицированных и здоровых                 проростках определяли феротиоцианатным методом. Навеску растительного материала гомогенизировали на холоде в 5%-ному растворе трихлоруксусной кислоты (ТХО), доводили раствором ТХО до 3 мл и центрифугировали             10 минуты при 5000 об/мин. До 3 мл супернатанта добавляли 0,4 мл 50%-ного раствору ТХО, 0,4 мл 10 мМ Fe(NH₄) 2(SO₄) 2, 0,2 мл 2,5 M KSCN. Оптическую плотность растворов измеряли на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 480 нм. Контролем служила проба без растительного материала. Концентрацию пероксида водорода рассчитывали по калибровочной кривой, построенной по Н₂О₂. Содержимое пероксида водорода рассчитывали по формуле:

  

 

где:

 
Х - содержание пероксидов водорода, мкМ / г сырого вещества; 
С - концентрация пероксидов водорода, мкМ / мл; 
3 - объем супернатанта, мл; 
m - навеска растительного материала, г. [7]

Статистическую обработку  экспериментальных данных проводили            методом двухфакторного дисперсионного анализа качественных и                              количественных признаков, а сравнение средних арифметических величин – методом Дункана [21].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3.ЕКСПЕРЕМЕНТАЛЬНАЯ  ЧАСТЬ

Инфицирование растений приводит к значительным метаболическим изменениям, которые можно считать защитными реакциями, что приводит  к повышению стойкости растений, к патогену. В сосне при инфицировании       H. annosum нарушается нормальное протекание физиолого – биохимических           процессов.  Патологические процессы,  обусловлены проникновением             H. annosum в ткани P. sylvestris,  проявляются в усилении свободно радикальных процессов и активации антиоксидантных систем. [14]. 

 

3.1.Перекисное  окисление липидов в  проростках Pinus sylvestris,      инфицированных грибом Heterobasidion annosum.

На 4 сутки после инфицирования  штаммом НЦСГ H. annosum   проростков P. Sylvestris  из семян темного (а) и светлого (б) цвета уровень перекисного окисления липидов значительно повышается по сравнению с контролем.

На 7 сутки после инфицирования  штаммом НЦСГ  H. annosum ,уровень перекисного окисления липидов достоверно снизился в проростках P. Sylvestris   из семян темного (а) и светлого (б) цвета, по сравнению с 4-ми сутками и     контролем.

На 10 сутки после инокуляции штаммом НЦСГ H. annosum ,уровень   перекисного окисления липидов достоверно снизился в проростках P.sylvestris  из семян темного (а) цвета, а в проростках P. sylvestris  из светлых (б) семян перекисное окисление достоверно превышает уровень контрольных             проростков.

 

       а

б

Рис.3.1.1.Перекисное окисление липидов в  инфицированных штаммом НЦСГ Heterobasidion annosum проростках Pinus sylvestris из темных (а) и светлых (б) семян.

 

На 4 сутки после  инфицирования  штаммом На-6-96 H.annosum                     перекисное окисление в проростках P. sylvestris, полученных из темных  семян, значительно выше по сравнению с контролем.

На 7 сутки после инфицирования  штаммом На-6-96 H. annosum уровень перекисного окисления достоверно повысился по сравнению со здоровыми проростками.