Диагностика чумы крупного рогатого скота

материал в разведении 1:20 и выше, а испытуемые культуральные про-

бы и сыворотки в разведении 1:10 и выше со специфическими компонен-

тами (сывороткой и антигеном) вызывают задержку гемолиза эритроци-

тов на 3-4 креста при полном гемолизе эритроцитов в аналогичных

разведениях испытуемых проб в смеси с нормальными компонентами

реакции.

 

За титр антигена или антител принимают наибольшее разведение

испытуемого материала, дающее задержку гемолиза эритроцитов на

3-4 креста с соответствующими  специфическими компонентами реакции.

 

3.2. Реакция диффузионной преципитации  в агаровом геле

3.2.1. Реакцию диффузионной преципитации  в агаровом геле

(РДП) применяют для прижизненной  и посмертной диагностики чумы

крупного рогатого скота путем обнаружения специфического антигена

в органо-тканевом материале сольных и павших животных и специфи-

ческих антител в сыворотках крови переболевших животных.

 

3.2.2. Компоненты реакции:

- 1% агаровая, среда;

- стандартные антигены и сыворотки;

- испытуемые антигены или сыворотки.

 

3.2.3. Для. приготовления, агаровой среды  используют бакто-агар

Дифко или отечественный агар после промывания, и сушки обычным спо-

собом (промывание в течение суток водопроводной,   затем  в течение

суток дистиллированной водой, сушка до исходного веса при комнат-

ной температуре).

 

Из агара готовят 1% гель на физиологическом растворе, к ко-

торому добавляют риванол 10 мг/куб.дм. Расплавленный агар фильтруют

через ватно-марлевый фильтр и разливают в чашки  Петри слоем

0,4-0,6 см. В затвердевшем агаре  по трафарету с помощью металли-

ческой трубки делают лунки диаметром 0,5 см на расстоянии 0,3-0,4см

друг от друга. Лунки располагают таким образом, чтобы одна из них

находилась в центре и 6 лунок вокруг неё.

 

Для обнаружения, антигена или антител в испытуемых пробах

РДП ставят одновременно с двумя стандартными (специфическим и

нормальным) компонентами реакции. При исследовании антигена в одну

из центральных лунок вносят стандартную специфическую, в другую -

стандартную нормальную сыворотки в рабочем разведении в объеме

по 0,1 куб.см. В периферические лунки разливают испытуемые антигены

в цельном виде (20% суспензия) в объеме по 0,1 куб.см. При исследова-

нии сывороток в центральные лунки вносят стандартные специфический

и нормальный антигены в рабочем разведении, а в периферические -

испытуемые сыворотки в цельном виде. При титровании испытуемых

антигенов и сывороток в РДП в периферические лунки вносят их

разведения от 1:2 до 1:32. Параллельно ставят контроля (специфи-

ческая и нормальная сыворотки с нормальным и  специфическим анти-

геном). После постановки реакции чашки Петри закрывают крышками,

ставят под стеклянный колпак и инкубируют при комнатной темпера-

туре в течение 18-24 ч.

 

Схема постановки РСК для обнаружения антигена.

Антигены по 0,1 куб.см	Сыворотки по 0,1 куб.см	Дозы комплемента по 0,1 куб.см
		0,02	0,03	0,04	0,05	0,06	0,07	0,08	0,09	0,1	Оценка результатов
Антиген испытуемый №1	СН	++ ++	++ ++	++ +-	+	-	-	-	-	-	Полож.
Антиген испытуемый №1	СС	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	-	-	.
Антиген испытуемый №2	СН	++ ++	++ ++	++ ++	+	-	-	-	-	-	Полож.
Антиген испытуемый №2	СС	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ +	+	-	-	.
Антиген испытуемый №3	СН	++ ++	++ ++	++ +-	-	-	-	-	-	-	Сомнит.
Антиген испытуемый №3	СС	++ ++	++ ++	++ ++	++	++	-	-	-	-	.
Антиген специф. (контроль)	СН	++ ++	++ ++	++ +-	+	-	-	-	-	-	Полож.
.	СС	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	+	-	.
Антиген нормальный (контроль)	СН	++ ++	++ ++	++ --	-	-	-	-	-	-	Отриц.
.	СС	++ ++	++ ++	++ +-	-	-	-	-	-	-	.

Примечание: СН-сыворотка нормальная,

            СС-сыворотка специфическая

Антиген испытуемый №4	++	-	-	-	-	-	-	-	-	Отрицат.	-
Разбавитель без антигена	-	-	-	-	-	-	-	-	-	Отрицат.	-

- ацетон х.ч. для фиксации препаратов;

- забуференный ФБР физиологический  раствор, рН 7,2;

- диметилфталат или нефлуоресцирующее  иммерсионное масло;

- люминесцентный микроскоп.

 

3.5.3. Для обнаружения, и идентификации  вируса чумы КРС методом ФА

используют первичную культуру клеток ПТ или перевиваемую культуру

клеток ПО, выращенные на предметных стеклах в пробирках. Из пробирок

со стеклами удаляют ростовую питательную среду, вносят по 0,3-0,5 куб.см

гепаринизированной крови или 20% суспензии органов и тканей от воль-

ных и павших животных и ставят на контакт при (37(1)°C на 1,5-2 ч.

Каждой пробой заражают не менее 10 пробирок со стеклами. После кон-

такта пробирки со стеклами трижды промывают раствором Хенкса, вносят

по 1,5-2 куб.см поддерживающей питательной среды и инкубируют в термо-

стате при (37(1)°C. Через 48-72 ч стекла извлекают из пробирок,

промывают в двух сменах за суверенного физраствора и подсушивают

на воздухе.

 

Приготовленные культуральные препараты фиксируют в охлажденном

(4(1)°C ацетоне в течение 10 мин , промывают  в двух-трех сменах

забуференного физиологического раствора, подсушивают на воздухе,

затем половину препаратов обрабатывают специфической сывороткой

в рабочем разведении, а другую половину - нормальной сывороткой

в том же разведении. Обработку препаратов ведут во влажной камере

при (37(1)°C в течение 30 мин. После этого все препараты промывают

в 3-х сменах забуференного физиологического раствора, подсушивают

на воздухе и аналогично обрабатывают антивидовой люминесцирующей

сывороткой, взятой в рабочем разведении. Через 30 мин.  препараты

промывают в 3-х сменах забуференного физиологического раствора и

один раз в дистиллированной воде, подсушивают на воздухе и просматри

вают под люминесцентным микроскопом.

 

При наличии в испытуемых материалах вируса чумы крупного рога-

того скота в препаратах, обработанных специфической и люминесцирую-

шей сыворотками, наблюдается яркое зеленовато-желтое или  изумрудно-зеленое

гранулярное или диффузионное свечениев цитоплазме пораженных клеток, при

отсутствии такого свечения в контрольных препаратах, обработанных нормальной и

люминесцирующей сыворотками.

 

3.6. Реакция нейтрализации

3.6.1. Реакцию нейтрализации (РН) при  чуме крупного рогатого

скота применяют для обнаружения вируснейтрализующих антител в сы-

воротках крови переболевших и вакцинированных животных, а также

для идентификации возбудителя болезни в патологическом материале

и инфицированной культуре клеток.

 

3.6.2. Компоненты реакции:

- стандартные специфическая и  нормальная сыворотки;

- вирус (вакцинный штамм К3770);

- первично-трипсинизированная культура  клеток  ПТ или переви-

ваемая культура клеток ПО, выращенные в пробирках;

- испытуемые пробы (пробы сывороток  крови, органо-тканевого

материала и гепаринизированной крови).

 

Все сыворотки для постановки РН используют пссле предваритель-

ной инактивацин при (56(1)°С в течение 30 мин.

 

3.6.3. Постановка качественной РН

Качественную РН применяют для  установления специфичности

вызываемых вирусом поражений культуры клеток (идентификации вируса)

С этой целью испытуемые кровь, органо-тканевой или культуральный

материал в разведении 1:10 соединяют с равным объемом специфической

сыворотки, взятой в том же разведении. В качестве контроля служит

смесь пробы с нормальной сыворотки крови крупного рогатого скота. Смеси

выдерживают при (4(1)°C в течение 16-18 ч. после чего 10 проби-

рок с культурой заражают смесью материала со специфической сыворот-

кой и 10 - смесью материала с нормальной сывороткой. Для этого

в каждую пробирку с культурой клеток вносят по 1куб.см смеси и ставят

на контакт при (37±1 )°С на 2 ч. После  контакта пробирки промы-

вают раствором Хенкса, вносят питательную среду и инкубируют в тер-

мостате при (37±1)°С в течение 12 сут. Смену питательной среды

проводят через каждые 3 дня. В качестве контроля, служат 4-6 проби-

рок с неинфицированной культурой клеток.

 

Учет результатов РН проводят путем ежедневного просмотра про-

бирок с культурой  клеток под световым микроскопом. Реакцию считают

положительной, если в пробирках с культурой, инфицированной смесью

пробы со специфической сывороткой, отсутствует поражение клеточного

монослоя при наличии ЦПД вируса в пробирках с культурой, инфициро-

ванной смесью пробы с нормальной сывороткой.

 

3.6.4. Постановка количественной  РН

 

Количественную РН проводят для определения титра антител

в крови переболевших и вакцинированных животных.

Для исследования в РН используют парные сыворотки не менее,

чем от 10 животных. Первый раз кровь берут в начале болезни и

второй - через 2-3 нед  после переболевания животных.

Количественную РН проводят с постоянной дозой вируса (200-

500 ТЦД 50)  и двукратными последовательными разведениями сыворотки

от 1:5 до 1:2560, которые смешивают в равных объемах.

 

Приготовленные смеси выдерживают при (4(1)°C в течение

16-18 ч. после чего каждым разведением  испытуемой сыворотки

в смеси с вирусом инфицируют по 4 пробирки с культурой клеток.

В качестве контроля, служат 4 пробирки с культурой, инфицированной

смесью вируса с нормальной сывороткой в разведении 1:10. Условия

инфицирования культуры, её инкубирования и сроки смены питательной

среды те же, что и при постановке качественной  РН.

 

Учет результатов количественной РН проводят путем ежедневного

просмотра пробирок с культурой под световым микроскопом.

 

За титр антител принимают наивысшее разведение сыворотки,

подавляющее развитие ЦПД вируса в 50 процентах пробирок с инфици-

рованной культурой клеток. Отсутствие антител в сыворотках крови,

взятых в начале болезни, и наличие их через 2-3 нед. в титре 1:5

и выше свидетельствует о переболевании животных чумой КРС. В слу-

чае течения, болезни по частично иммунному фону четырехкратное и

более увеличение титра антител в сыворотках крови, взятых через

2-3 нед,  свидетельствует об инфекции, имевшей место среди об-

следуемых животных.

 

3.7. Выделение вируса в чувствительных  культурах клеток

Для выделения вируса чумы КРС используют первично-трипсинизи-

рованную культуру клеток ПТ или перевиваемые культуры клеток ПО

и СПЭВ.

 

В пробирки с монослоем клеток после удаления ростовой среды

вносят кровь, лейкоцитарную фракцию крови или 10% осветленную

центрифугированием суспензию органов и тканей от больных и павших

животных в объеме 0,2-0,3 куб.см и ставят на контакт на 1,5-2 ч.

при (37(1)° С. После контакта пробирки трижды промывают раствором

Хенкса, вносят по I см3 поддерживающей питательней среды и инкуби-

руют в термостате при  (37(1)° С в течение 10-12 сут.

 

Каждой пробой заражают не менее 10 пробирок с культурой

клеток. Контролем служат пробирки с неинфицированной культурой

клеток. Смену среды в пробирках с инфицированной и  неинфицирован-

ной культурой клеток проводят через каждые 2-3 дня. Просмотр зара-

женной культуры осуществляют под световым микроскопом ежедневно.

При отсутствия ЦПД в зараженной культуре клеток через 10-12 сут

проводят второй и третий пассажи. При наличии ДПД в инфицирован-