Шпаргалка по "Микробиологии"

В большей степени методы индикации НК нашли применение в диагностике вирусных инфекций, хотя существуют и спец системы для индикации некоторых прихотливых бактерий (легионелл, хламидий, энтерококков, микобактерий и др).

Наиболее распространены МЕТОДЫ ГИБРИДИЗАЦИИ ДНК И РНК. Принцип: ДНК (и РНК) способны специфически связываться (гибридизироваться) с комплементарными фрагментами искусственно созданных нитей ДНК (РНК), меченых изотопами или ферментами (пероксидаза, ЩФ…). Затем образцы исследуют методом ИФА.

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ. Была предложена в 1983г. Принцип: многократное образование копий (амплификация) определённого участка ДНК с помощью ДНК-полимеразы. ЭТАПЫ:

ТЕРМИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ 2-хнитевой ДНК на отдельные цепочки (93-95°С в течение 30 секунд).

ОХЛАЖДЕНИЕ СРЕДЫ И ВНЕСЕНИЕ ПРАЙМЕРОВ, комплементарных нуклеотидным последовательностям обоих цепочек. Используют синтетические праймеры – олигонуклеиды из 10-20 НКт, взаимодействующих с концами отдельных нитей исходной ДНК. Точнее добавляют 2 праймера (комплиментарны). Взаимодействие праймеров называют ОТЖИГОМ (реакция проходит за 20-60 с при 50-65°С).

Вносят СПЕЦ ТЕРМОСТАБИЛЬНУЮ ПОЛИМЕРАЗУ (оптимум 70°С), к/я синтезирует вторичные копии цепей ДНК (ампликоны).

Полученные 2-хнитчатые ДНК снова подогревают, остужают, вносят праймеры и т.д.

Т.к. полимераза устойчива к воздействию t°С, то нет необходимости постоянно её добавлять. После 30-80 циклов проводят идентификацию ДНК методом электрофореза. Подсчитано, что за 30-40 циклов из 1 матрицы образуется 100.000.000 (100 млн) ампликонов. Для подтверждения принадлежности ДНК возбудителю молекулы можно подвергнуть рестрикции специфическими эндонуклеазами или провести ДНК-гибридизацию. ПЦР – оч чувствительный метод, теоретически достаточно иметь в среде лишь 1 молекулу ДНК.

Для ДИАГНОСТИКИ ИНФ ЗАБ-Й маркёром возбудителя явл его геном. Для амплификации отбирают какой-нибудь УНИКАЛЬНЫЙ ген, наиболее отличающий его от других патогенов.

30. Биопрепараты для создания  активного иммунитета. Вакцины, анатоксины. Принципы их получения.

Препараты для иммунопрофилактики и иммунотерапии инфекционных заболеваний делятся на:

вакцины и анатоксины – для индукции специфического иммунного ответа с формированием активного противоинфекционного иммунитета за счет мобилизации механизмов иммунологической памяти;

иммунные сыворотки и Ig – содержат готовые специфические АТ (Ig), введение которых в Ò приводит к немедленному приобретению пассивного гуморального иммунитета, способного защитить организм от интоксикации или инфекции.

ВАКЦИНЫ (Э. Дженнер, Л. Пастер) – биопрепараты, предназначенные для создания активного искусственного иммунитета. Делятся на живые, убитые, химические, анатоксины и ассоциированные. Готовят т/же аутовакцины – из штаммов мкÒ, выделенных непосредственно из Ò чка.

ЖИВЫЕ ВАКЦИНЫ создают напряженный иммунитет, сходный с постинфекционным. Готовятся из АТТЕНУИРОВАННЫХ штаммов (т.е. вирулентные свойства утрачены, но при введении в Ò способны прижиться и вызвать выработку ВСЕХ ВИДОВ иммунитета). В большинстве случаев достаточно однократной вакцинации живой вакциной, т.к. вакцинный штамм может размножаться и персистировать в Ò. Применение живых вакцин опасно для людей (особенно детей) с врожденными или приобретенными иммунодефицитными состояниями → тяжелые инфекционные осложнения. Для получения используют следующие методы:

селекционный метод, направленный на выращивание мкÒ в неблагоприятных условиях отбор микробов со ↓ вирулентностью – классический метод получения живых вакцин (Пастер – сиб язва).

Адаптация мкÒ к Ò невосприимчивого Ж! или пассирование через ткани и органы, к/е не являются входными воротами для данного мкÒ.

Отбор мутантных штаммов со ↓ вирулентностью, выделенных из природы.

Методы генной инженерии.

УБИТЫЕ ВАКЦИНЫ готовят из мкÒ, обладающих максимально выраженной иммуногенностью. Их выращивают (на биопредприятиях), затем инактивируют t°С (55-60° в течение 1часа), УФ или хим в-вами (формалин, фенол, спирт и др) в условиях, исключающих денатурацию антигенов. Для профилактики – брюшного тифа, паратифов А и В, коклюша, бруцеллёза, лептоспироза… Для лечения – при вялотекущих и хронических инфекциях: бруцеллёз, туляремия, дизентерия, гоноррея, коклюш… Убитые вакциины создают ненапряжённый иммунитет.

Аттенуированный или убитый возбудитель – это множество различных АГ детерминант, но индуцировать защитный иммунитет могут немногие из них Þ очистить вакцинный препарат от токсичных или аллергизирующих компонентов. Выделение из Б!# АГ компонентов позволило получить вакцины второго поколения – ХИМИЧЕСКИЕ.    По сравнению с др вакцинами они менее реактогенны. Аналогами Б! хим вакцин являются вирусные субъединичные (расщепленные) вакцины, содержащие лишь некоторые наиболее иммуногенные компоненты вирионов (противогриппозная вакцина, включающая гемагглютинин и нейраминидазу). Субъединичные вакцины оказались наименее реактогенными, но и наименее иммуногенными.

Для ↑ ИММУНОГЕННОСТИ химических и субъединичных вакцин к ним добавляют разного рода адъюванты (adjuvans – помогающий, поддерживающий): гидрооксид алюминия, алюминиево-калиевые квасцы, фосфат алюминия и др. Те же адъюванты добавляют для повышения иммуногенности и к препаратам анатоксинов.

АНАТОКСИНЫ получают путем обработки токсинов формалином (0,3% раствор) при температуре 37°С в течение 30 дней. При этом токсин утрачивает ядовитость, но сохраняет способность индуцировать синтез АТ. Анатоксинами широко пользуются для выработки активного антитоксического иммунитета при специфической профилактике столбняка, дифтерии и других инфекций, возбудители которых продуцируют экзотоксины.

ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ:

получение в чистом виде эпитопов и их связывание с молекулой-носителем (природные белки, синтетические полиэлектролиты).

Генноинженерные методы: определяют гены, контролирующие нужные АГ детерминанты, переносят в геном других мкÒ и клонируют в них, добиваясь экспрессии этих генов в новых условиях.

На основе антиидиотипических антител.

Использование липосом для введения АГ. Благодаря их сходству с клеточными мембранами они не токсичны для Ò, заключенное в них вещество защищено от растворения в крови и они могут адсорбироваться на клетках. Такие «липосомные» вакцины вызывали тысячекратное усиление иммунного ответа.

Часть вакцин используется для обязательной ПЛАНОВОЙ ВАКЦИНАЦИИ детей: противотуберкулезная вакцина BCG, полиомиелитная вакцина, коревая, паротитная, АКДС.

Другие вакцины обязательны для введения определенным контингентам в определенных районах (например, вакцина против клещевого энцефалита) или при опасности профессиональных контактов с возбудителем.

Общие требования к вакцинам: высокая иммуногенность, ареактогенность (отсутствие выраженных побочных реакций), безвредность и минимальное сенсибилизирующее действие.

31. Биопрепараты для создания  пассивного иммунитета. Лечебные  сыворотки и иммуноглобулины. Принципы  их получения.

Препараты для иммунопрофилактики и иммунотерапии инфекционных заболеваний делятся на:

вакцины и анатоксины – для индукции специфического иммунного ответа с формированием активного противоинфекционного иммунитета за счет мобилизации механизмов иммунологической памяти;

иммунные сыворотки и Ig – содержат готовые специфические АТ (Ig), введение которых в Ò приводит к немедленному приобретению пассивного гуморального иммунитета, способного защитить организм от интоксикации или инфекции.

ИММУННЫЕ СЫВОРОТКИ И Ig

При многих инфекциях АТ играют защитную роль. Однако накопление достаточного количества антител наблюдается, как правило, не ранее чем через 2-3 нед после начала заболевания. Поэтому искусственное создание пассивного иммунитета показано при многих инфекциях как с целью серотерапии, так и с целью экстренной серопрофилактики (при непосредственной угрозе заболевания).

Иммунные сыворотки получают путем гипериммунизации лошадей, от которых можно получить сравнительно много крови, с последующей обработкой иммунной сыворотки (для концентрации АТ и очистки от балластных веществ методами ферментирования и диализа («Диаферм»)).

Силу антитоксических сывороток измеряют в международных единицах (ME) по способности нейтрализовать определенную дозу токсина.

Т.к. лошадиные сыворотки являются гетерологичными, они могут вызывать, особенно при повторном введении в организм, аллергические реакции на лошадиный белок Þ обязательный предварительный контроль на чувствительность организма к лошадиному белку (внутрикожная проба с 0,1 мл лошадиной сывороткой в разведении 1:100). Введение допустимо только если нет выраженной кожной реакции в течение 20–30 мин.

Антитоксические иммунные сыворотки нужно вводить как можно раньше от момента заражения, так как АТ нейтрализуют токсин только до его адсорбции на клетке-«мишени».

Для уменьшения побочных эффектов из иммунных сывороток выделяют чистые Ig, также используют гомологичные человеческие сыворотки. Сырьем для приготовления нормального Ig человека может служить плазма крови доноров, сыворотка плацентарной крови. Использование Ig человека для экстренной профилактики и лечения кори, коклюша, менингококковой инфекции, полиомиелита, скарлатины обусловлено присутствием АТ против соответствующих возбудителей в крови взрослых людей, вследствие бытовой иммунизации, перенесенных инфекций или вакцинации против них.

От специально иммунизированных доноров получают сыворотку крови для приготовления Ig целенаправленного действия для экстренной профилактики и лечения столбняка, клещевого энцефалита, гриппа, стафилококковой инфекции. Противоэнцефалитный иммуноглобулин получают из сывороток крови людей, проживающих в местах распространения данного заболевания, содержащих достаточно высокий уровень специфических противовирусных АТ.

Для создания пассивного иммунитета очень перспективно получение препаратов моноклональных АТ на основе гибридом из клеток человека. Такие препараты будут обладать наиболее целенаправленным действием при минимальных возможностях осложнений.

32. Диагностические биопрепараты. Диагностикумы для серологических  реакций. Диагностические сыворотки. Принципы их получения.

Диагностикумы бывают:

а) антигенными – получают из возбудителя, либо ипользуют самого возбудителя

б) антительными – иммунные диагностические сыворотки – получают иммунизацией лабор. животных.

Напр., используют сыворотки против лейкоцитарных АГ – для типирования донора и реципиента (при пересадках органов).

33. Иммунологическая толерантность. Определение понятия, механизмы формирования иммунологической толерантности.

Иммунологическая толерантность – явление специфической иммунной ареактивности, приобретенной в результате предшествующего контакта с этим Аг. Это явление неспособности иммунной системы ответить на присутствие Аг.

Механизмы

А. Центральные связаны с непосредственным влиянием на функцию иммунных клеток:

1) клональное абортирование

2) клональная делеция –  элиминация антигеном имм. клеток  в тимусе (вероятно, апоптоз незрелых Т-лимфоцитов наступает вследствие воздействия на них Аг без сопутствующих сигналов – интерлейкина I и интерлейкина II), а также клеток В-зависимой популяции

3) повышение активности  супрессорных Т-клеток

4) блокада эффекторных  клеток (напр., блокада синтеза В-клеткой  антител вследствие связывания  её антигенных рецепторов поливалентным  антигеном

5) блокада, опосредованная  введенными антителами – искусственно  введенные АТ быстро элиминируют  Аг и имм.ответ на развивается.

6) отсутствие контрсупрессии Þ Т-хелперы не активируются

Б. Периферические не связаны с изменением функции иммунокомпетентных клеток. Обуславливают в некоторых системах состояние видимой ареактивности: "перегрузка антигеном", сывороточные антитела

34. Клеточные факторы иммунитета  для оценки иммунного статуса  организма (Е-РОК, РБТЛ, РТМЛ ).

Метод Е-РОК (Е-розеткообразующих клеток)

Этот метод – общепризнанный стандартый метод колич. учета Т-лимфоцитов в периферической крови людей.

При смешивании лимфоцитов чка и эритроцитов Баранова последние избирательно адсорируются только Т-лимфоцитами и образуют т.н. Е-розетки.

Розеткообразующей клеткой (РОК) считается лимфоцит, присоединивший 3 и более эритроцитов Баранова. Исходя из абсолютного кол-ва лейкоцитов в 1 л крови вычисляют абсолютное кол-во Т-лимфоцитов в 1 л крови.

У здоровых людей Т-лимфоциты составляют 40-70% общего числа лимфоцитов.

РБТЛ (реакция бласттрансформации лимфоцитов

Основан на наличии митогенов, специфически действующих на Т- или на В-лимфоциты, что позволяет раздельно судить о функциональной активности Т- и В-клеток. (Так, ФГА и конканавалин А стимулируют Т-кл., а митоген Лапокосса и ЛПС эшеришии (E.coli) – В-клетки. Схема постановки реакции:

1) выделение лимфоцитов

2) подсчет кол-ва клеток  и доведение суспензии до нужной  концентрации

3) посев клеток и их  последующее культивирование в  течение 72 часов

4) регистрация результатов, включая:

  а) приготовление мазков  для подсчета процента стимулированных  лимфоцитов

  б) определение интенсивности  включения Н-3-тимидина (3Н)

РТМЛ (реакция торможения миграции лейкоцитов)

Используется для изучения акитвности лимфокининов. В основе РТМЛ лежит способность гранулоцитов и моноцитов крови, а также макрофагов к свободной миграции, которая тормозится под действием лимфокина. Миграцию и ее торможение под влиянием лимфокинов изучают в специальных капиллярах или на стекле под слоем агарозы. Результаты ингибиции миграции оценивают по разности площадей миграции клеток.

Оценка гуморального иммунитета (В-системы) включает определение кол-ва В-лимфоцитов в крови с помощью теста розеткообразования лимфоцитов с эритроцитами, несущими на своей поверхности комплекс (антиэритроцитарные АТ + комплемент), с целью выявления на лимфоцитах рецепторов для комплемента и теста иммунофлюоресценции с использованием антисывороток против иммуноглобулинов чка.  Функциональную активность В-лимфоцитов оценивают косвенно по уровню сывороточных иммуноглобулинов различных классов – IgG, IgM, IgA, IgE.