Иммобилизация и стабилизация ферментов

В настоящее время известны сотни наследственных заболеваний, связанные с дефектами ферментов. Разработаны методы лечения и профилактики многих из таких болезней.

 

Болезни, связанные с нарушением выработки ферментов.

Отсутствие или снижение активности какого-либо фермента (нередко и избыточная активность) у человека приводит к развитию заболеваний (энзимопатий) или гибели организма. Например, передаваемое по наследству заболевание детей – галактоземия (приводит к умственной отсталости) – развивается вследствие нарушения синтеза фермента, ответственного за превращение галактозы в легко усваиваемую глюкозу. Причиной другого наследственного заболевания – фенилкетонурии, сопровождающегося расстройством психической деятельности, является потеря клетками печени способности синтезировать фермент, катализирующий превращение аминокислоты фенилаланина в тирозин. Определение активности многих ферментов в крови, моче, спинномозговой, семенной и других жидкостях организма используется для диагностики ряда заболеваний. С помощью такого анализа сыворотки крови возможно обнаружение на ранней стадии инфаркта миокарда, вирусного гепатита, панкреатита, нефрита и других заболеваний.

 

В медицине используются следующие ферменты:

1) Ферменты коррекции пищеварения.

Липазы, протеазы из различных источников используются как дополнительные ферменты, облегчающие разложение жиров и белков на составные части в процессе пищеварения.

 

2) Ферменты наружного применения.

На основе иммобилизованных протеаз различного происхождения созданы перевязочные материалы, улучшающие заживление ран.

 

3) Тромболитические ферменты.

Существенный прогресс в лечении сердечно-сосудистых заболеваний связывают с применением ферментов, растворяющих фибриновые тромбы. Это направление обеспечивается большим набором протеолитических ферментов. Активация плазминогена на фибриновом сгустке обеспечивает основной естественный процесс тромболизиса. Созданы химически модифицированные по активному центру производные плазминогена, пролонгирующие действие фермента и регулирующие процесс тромболизиса. Для растворения фибриновых тромбов используются протеазы бактериального происхождения – стрептокиназа и стафилокиназа. Создание эффективных тромболитических агентов связывают с тканевым активатором плазминогена и протеолитическим ферментом – урокиназой. Получены генно-инженерные варианты урокиназы, и на этой основе создан фармакологический препарат.

 

4) Ферменты противоопухолевой терапии.

Торможение роста опухолей в этом случае основано на селективной ферментативной модификации ряда аминокислот, используемых раковыми клетками для пролиферации роста. Терапевтически значимыми ферментами этого направления являются лизиноксидаза, аспарагиназа и др. Сдерживающим фактором широкого применения ферментов как медицинских препаратов является их иммуногенность. Многократное введение чужеродного белка в систему крови человека может вызвать синтез соответствующих антител и развитие иммунного ответа. Инженерная энзимология находит решение этой проблемы в использовании растворимых конъюгатов ферментов с синтетическими полимерами. Показано, что во многих случаях при соответствующем подборе полимера иммуногенность белка может быть существенно снижена.

 

Существуют также вещества-антиферменты.

Антиферменты (от греч. анти "против", "наоборот" и ферменты) – представляют собой специфические вещества имеющие белковое происхождение. Они выделяются в результате процессов жизнедеятельности организма. Главное их функциональное предназначение – это тормозить или полностью блокировать действие ферментов, что достигается путём образования при взаимодействии с ферментами неактивных комплексов. Те антиферменты, которые присутствуют в различных органах и тканях организма, предохраняют эти органы и ткани от негативных воздействий соответствующих ферментов. В качестве примера можно привести антиферменты, обеспечивающие устойчивость стенок желудка и кишечника и предохраняющие их от разъедающего действия достаточно агрессивных пищеварительных ферментов, содержащихся в желудочном соке. Научное изучение свойств антиферментов также помогает учёным получать новые медикаменты, обладающие свойствами антиферментов. К ним можно отнести такие препараты как эзерин, прозерин, фокурит (диакарб), трасилол и др.

 

 

 

 

Иммобилизация ферментов.

 

За последние 15-20 лет ферменты стали полноправными компонентами технологических схем производства. Это было достигнуто путем развития методов иммобилизации ферментов, то есть фиксации их на каких-то нерастворимых материалах. Иммобилизация предотвращает разрушение ферментов, увеличивают срок их действия, превращает их в гетерогенный катализатор (например, в виде зерен).

Под иммобилизацией понимают такую процедуру, в результате которой молекула фермента тем или иным способом прикрепляется к определенным объектам (носителям), нерастворимых в воде (англ. immobilis – неподвижный). Эти объекты вместе с ферментом легко отделяются от раствора после завершения реакции. Химическое «пришивание» фермента к носителю закрепляет конформацию фермента, и является причиной повышения устойчивости и снижения лабильности.

Иммобилизованные ферменты есть вроде модели структурно организованных в клетке ферментов (мембрана – это то же нерастворимое основание для сообщения с ферментом). Примерно в 70-х гг. XX в. на стыке определенных химических и биологических дисциплин сформировалось новое научно-инженерное направление: инженерная энзимология (важнейший раздел биотехнологии), стремительное развитие которой обусловил создание новых типов гетерогенных биоорганических катализаторов – иммобилизованных ферментов.

По сравнению с нативными предшественниками иммобилизованные ферменты имеют ряд преимуществ при их использовании с прикладной целью.

Во-первых, иммобилизованный фермент как гетерогенный катализатор можно легко удалить с реакционной среды, что дает возможность:

- остановить в нужный момент реакцию; 

- еще раз использовать катализатор;

- получить продукт, не загрязненный ферментом, что особенно важно для пищевого и фармацевтического производства.

Во-вторых, использование гетерогенных катализаторов позволяет осуществлять ферментативный процесс непрерывно, например, в проточных колонках, и регулировать скорость реакции, которую катализируют, а также регулируют выход продукта путем изменения скорости потока.

В-третьих, иммобилизация или модификация фермента способствует целенаправленному изменению свойств катализаторов, в том числе его специфичности, зависимости каталитической активности от рН, ионного состава и других параметров среды, и, что очень важно, его стабильности относительно разного рода денатурирующих воздействий.

В-четвертых, иммобилизация ферментов дает возможность регулировать их каталитическую активность путем изменения свойств носителя под влиянием некоторых физических факторов (свет, звук и др.).

Основные требования, которым должны соответствовать носители: 

- высокая химическая и биологическая стойкость; 

- высокая механическая прочность; 

- достаточная проницаемость для фермента и субстратов; 

- высокая пористость; 

- возможность получения в виде удобных в технологическом отношении форм (гранул, мембран, труб, листов и т.д.); 

- легкий перевод в реакционно-способную форму (активация):

- высокая гидрофильность, которая обеспечивает возможность проведения реакции связывания фермента с носителем в водной среде; 

- невысокая стоимость.

 

Материалы (носители) для иммобилизации ферментов.

По Дж. Порату (1974), идеальные материалы используемые для иммобилизации ферментов, должны обладать следующими свойствами:

1.Нерастворимостью;

2.Высокой химической и биологической стойкостью;

3.Значительной гидрофильностью;

4.Достаточной проницаемостью как для ферментов, так и для субстратов и продуктов реакции;

5. Способностью носителя легко  активироваться.

 

В зависимости от природы носители делятся на:

1. Органические материалы;

2. Неорганические материалы.

Органические полимерные носители можно разделить на 2 класса:

а) природные;

б) синтетические.

В свою очередь, каждый из классов органических полимерных носителей подразделяется на группы в зависимости от их строения. Среди природных полимеров выделяют: белковые; полисахаридные; липидные носители, а среди синтетических:

- полиметиленовые;

- полиамидные;

- полиэфирные.

К преимуществам природных носителей относят

1. Доступность;

2. Полифункциональность;

3. Гидрофильность

Из недостатков – высокая стоимость.

Из полисахаридов для иммобилизации наиболее часто используют: целлюлозу, декстран, агарозу и их производные. Для придания химической устойчивости их линейные цепи поперечно сшивают эпихлоргидрином. В полученные сетчатые структуры легко вводят различные ионогенные группировки.

Из природных аминосахаридов в качестве носителей для иммобилизации применяют хитин, который в значительных количествах накапливается в виде отходов в процессе промышленной переработки крабов и креветок. Хитин химически стоек и имеет хорошо выраженную пористую структуру.

Среди белков практическое применение в качестве носителей нашли структурные протеины, такие как: кератин, фиброин, коллаген и продукт переработки коллагена – желатин. Эти белки широко распространены в природе, поэтому доступны в больших количествах, дешёвы и имеют большое число функциональных групп для связывания фермента. Белки способны к биодеградации, что очень важно при конструировании иммобилизованных ферментов для биотехнологических целей.

Синтетические полимерные носители включают полимеры на основе стирола, акриловой кислоты, поливинилового спирта, полиамидные и полиуретановые полимеры.

Их преимущества:

1.Механическая прочность;

2.Возможность варьирования в широких пределах величины пор и введения различных функциональных групп.

Синтетические полимеры воспроизведены в таких изделиях, как трубы, волокна, гранулы. Все эти свойства полезны для разных способов иммобилизации ферментов.

Основное преимущество неорганических носителей – легкость регенерации. Подобно синтетическим полимерам неорганическим носителям можно придать любую форму и получать их с любой степенью пористости. Итак, к настоящему времени создано огромное число разнообразных носителей для иммобилизации ферментов. Однако для каждого индивидуального фермента, используемого в конкретном технологическом процессе, необходимо подбирать оптимальные варианты как носителя, так и условий и способов иммобилизации.

Иммобилизованные ферменты долговечны и в десятки тысяч раз стабильнее свободных энзимов. Так, происходящая при температуре 65° С термоинактивация лактатдегидрогеназы, иммобилизованной в 60%-м полиакриламидном геле, замедлена в 3600 раз по сравнению с нативным ферментом.

Это обеспечивает высокую экономичность, эффективность и конкурентоспособность технологий, использующих иммобилизованные ферменты.

Иммобилизация осуществляется путем физической адсорбции ферментов на нерастворимом материале, включением ферментов в ячейки геля, а также ковалентным связыванием фермента с нерастворимым материалом или молекул фермента между собой с образованием нерастворимых полиферментных комплексов. Как адсорбенты используют стекло, силикагель, гидроксиапатит, целлюлозу и ее производные, хитин, декстран и др. Для включения фермента в ячейки геля используют разнообразный гелеобразующий материал, чаще полиакриламидный гель. Как материал для ковалентного связывания ферментов применяют полипептиды, белки, производные стирола, полиакриламид, нейлон, различные производные целлюлозы, крахмал, агар, агарозу, а также стекло, силикагель и т.п. При ковалентной связке ферменты находятся на химическом поводке у нерастворимого носителя.

При иммобилизации ферментов используют те же принципы, что и при аффинной хроматографии. Аффинная хроматография основывается на биоспецифическом взаимодействии выделяемого биополимера или группы полимеров с определенным веществом. Этот вид хроматографии применяется у ферментов, иммуноглобулинов, рецепторных белков, которые способны избирательно по типу комплементарности связываться с субстратами, рецепторами, антигенами, ингибиторами, кофакторами. Принцип этого метода хроматографии состоит в том, что на нерастворимом носителе закрепляют вещество, способное специфически связываться с белком. Это вещество называют лигандом. Обработанный таким образом носитель (адсорбент) помещают в колонку и через нее пропускают смесь белков. С адсорбентом связывается только тот белок, который имеет сродство со специфическим лигандом. Затем белок снимают с колонки раствором, вызывая диссоциацию комплекса, который образовался между белком и лигандом.