Иммобилизация и стабилизация ферментов

Как известно, в клетках ферменты находятся не в растворённой форме, а прикреплены к определённым структурам и локализованы в органеллах. Это связано с тем, что ферменты не стабильные соединения и при воздействии ряда физических и химических факторов могут инактивироваться.

 

 

Методы иммобилизации ферментов.

 

Как мы уже говорили, иммобилизованные ферменты (от лат. immobiiis – неподвижный), препараты ферментов, молекулы которых связаны с матрицей, или носителем (как правило, полимером), сохраняют свои каталитические свойства полностью или частично. Иммобилизованные ферменты обычно не растворяются в воде. Между двумя фазами возможен обмен молекулами субстрата, продуктов каталитической реакции, ингибиторов и активаторов. Существует несколько основных способов иммобилизации ферментов:

1) адсорбционный метод

1) путем образования ковалентных  связей между ферментом и матрицей;

2) полимеризацией мономера, образующего  матрицу, в присутствии фермента, который при этом оказывается  включенным в сетку полимера – обычно геля;

3) электростатическое взаимодействие противоположно заряженных групп фермента и матрицы;

4) сополимеризацией фермента и  мономера, образующего матрицу;

5) связыванием фермента и матрицы  в результате нековалентных взаимодействий – гидрофобных, с образованием водородных связей и др.;

6) инкапсулированием – созданием  около молекул фермента полупроницаемой  капсулы, например, включением фермента в липосомы;

7) сшиванием молекул фермента  между собой, например, глутаровым альдегидом, диметиловым эфиром адипиновой кислоты.

 

Существуют два принципиально различных метода иммобилизации ферментов:

1.Без возникновения ковалентных  связей между ферментом и носителем (физические методы иммобилизации);

2.С образованием ковалентной  связи между ними (химические методы иммобилизации).

Каждый из этих методов осуществляется разными способами (рис.  2).

 

Рис. 2.

 

Адсорбционная иммобилизация является наиболее старым из существующих способов иммобилизации ферментов, начало ей было положено еще в 1916 г. Этот способ достаточно прост и достигается при контакте водного раствора фермента с носителем. После отмывки не адсорбировавшегося белка иммобилизованный фермент готов к использованию. Удерживание адсорбированной молекулы фермента на поверхности носителя может обеспечиваться за счет водородных связей, электростатических и гидрофобных взаимодействий между носителем и поверхностными группами белка. Вклад каждого из типов связывания зависит от химической природы носителя и функциональных групп на поверхности молекулы фермента. Взаимодействия с носителем могут оказаться настолько сильными, что сорбция биокатализатора может сопровождаться разрушением его структуры. Например, при адсорбции некоторых растительных клеток на гранулах цитодекса клеточная стенка деформируется, повторяя рельеф поверхности частиц носителя. Преимуществом метода адсорбционной иммобилизации является доступность и дешевизна сорбентов, выступающих в роли носителей. Им также можно придать любую конфигурацию и обеспечить требуемую пористость. Важный фактор – простота применяемых методик. При адсорбционном связывании можно решить и проблему очистки фермента, так как связывание белка с носителем во многих случаях достаточно специфическое. К сожалению, прочность связывания фермента с носителем не всегда достаточно высока, что ограничивает применение метода. К недостаткам адсорбционной иммобилизации следует отнести отсутствие общих рекомендаций, позволяющих сделать правильный выбор носителя и оптимальных условий иммобилизации конкретного фермента, а также невысокую прочность связывания фермента с носителем. При изменении условий иммобилизации может произойти десорбция фермента, его потеря и загрязнение продуктов. Существенно повысить прочность связывания фермента с носителем может предварительная его модификация (обработка ионами металлов, полимерами, белками, гидрофобными соединениями, монослоем липида).

 

Иммобилизация ферментов путем включения в гели.

Суть этого метода иммобилизации состоит в том, что молекулы фермента включаются в трехмерную сетку из тесно переплетенных полимерных цепей, образующих гель. Среднее расстояние между соседними цепями в геле меньше размера молекулы включенного фермента, поэтому он не может покинуть полимерную матрицу и выйти в окружающий раствор, т.е. находится в иммобилизованном состоянии. Дополнительный вклад в удерживание фермента в сетке геля могут вносить также ионные и водородные связи между молекулой фермента и окружающими ее полимерными цепями. Пространство между полимерными цепями в геле заполнено водой, на долю которой обычно приходится значительная часть всего объема геля. Например, широко применяемые гели полимеров акриловой кислоты в зависимости от концентрации полимера и его природы содержат от 50 до 90% воды.

Для иммобилизации ферментов в геле существует два основных способа. При одном из них фермент помещают в водный раствор мономера, а затем проводят полимеризацию, в результате чего образуется полимерный гель с включенными в него молекулами фермента. В реакционную смесь часто добавляют также бифункциональные (содержащие в молекуле две двойные связи) сшивающие агенты, которые придают образующемуся полимеру структуру трехмерной сетки. В другом случае фермент вносят в раствор готового полимера, который затем каким-либо образом переводят в гелеобразное состояние. Способ иммобилизации ферментов путем включения в полимерный гель позволяет создавать препараты любой геометрической конфигурации, обеспечивая при этом равномерное распределение биокатализатора в объеме носителя. Метод универсален, применим для иммобилизации практически любых ферментов, полиферментных систем, клеточных фрагментов и клеток. Фермент, включенный в гель, стабилен, надежно защищен от инактивации вследствие бактериального заражения, так как крупные клетки бактерий не могут проникнуть в мелкопористую полимерную матрицу. В то же время, эта матрица может создавать значительные препятствия для диффузии субстрата к ферменту, снижая каталитическую эффективность иммобилизованного препарата, поэтому для высокомолекулярных субстратов данный метод иммобилизации не применим вообще.

Иммобилизация ферментов в гелях обеспечивает равномерное распределение энзима в объёме носителя. Все гели обладают высокой механической, химической, тепловой и биологической стойкостью и обеспечивают возможность многократного использования фермента, включённого в его структуру.

 

Иммобилизация ферментов в полупроницаемые структуры 
(инкапсулирование и включение ферментов в липосомы).

Сущность этих способов иммобилизации заключается в отделении водного раствора фермента от водного раствора субстрата с помощью полупроницаемой мембраны, пропускающей низкомолекулярные молекулы субстратов, но задерживающей большие молекулы фермента. Разработано две модификации этого направления, которые представляют собой микрокапсулирование и включение ферментов в липосомы.

Метод инкапсулирования разработан Т. Чангом в 1974 г. и состоит в том, что водный раствор фермента включается внутрь замкнутой микрокапсулы, стенки которой образованы полупроницаемым полимером или мембраной. Один из механизмов возникновения мембраны на поверхности водных микрокапсул фермента заключается в реакции межфазной поликонсистенции двух соединений, одно из которых растворено в воде, а другое  – в органической фазе.

Размер получаемых капсул составляет сотни микрометров, а толщина мембраны – сотые доли микрометра.

Достоинство метода микрокапсулирования – простота, универсальность, возможность многократного использования нативного фермента, поскольку он может быть отделён от непрореагировавшего субстрата процедурой простого фильтрования. Особенно существенно, что методом микрокапсулирования могут быть иммобилизованы не только индивидуальные ферменты, но и целые клетки и отдельные фрагменты клеток. К недостаткам метода следует отнести невозможность инкапсулированных ферментов осуществлять превращения высокомолекулярных субстратов.

Близким к инкапсулированию вариантом иммобилизации является метод включения водных растворов ферментов в липосомы, т. е. двойные липидные (жировые) шарики. Впервые данный метод был применён для иммобилизации ферментов Дж. Вайсманом и Дж. Сессом в 1970 году. Для получения липосом из растворов липида (чаще всего лецитина) упаривают органический растворитель. Оставшуюся тонкую плёнку липидов выдерживают в водном растворе, содержащем фермент. В процессе выдержки происходит самовпитывание (самосборка) липидных структур липосомы. Ферменты, иммобилизованные путём включения в структуру липосом, используют преимущественно в медицинских и биотехнологических целях.

 

Химические методы иммобилизации ферментов.

Эти методы представляют иммобилизацию ферментов путём образования новых ковалентных связей между ферментом и носителем – наиболее массовый способ получения промышленных биокатализаторов. 
В отличие от физических вариантов, эти методы иммобилизации обеспечивают прочную и необратимую связь фермента с носителем и сопровождаются стабилизацией молекулы энзима. Однако расположение фермента относительно носителя на расстоянии одной ковалентной связи создаёт трудности в осуществлении каталитического процесса. Ферменты отделяют от носителя с помощью вставки (сшивка, или спейсер), в роли которой чаще всего выступают полифункциональные агенты бромциан, гидразин, глутаровый диальдегид. В этом случае структура иммобилизованного фермента включает носитель, вставку и фермент, соединённые между собой ковалентными связями.

Главным отличительным признаком химических методов иммобилизации является то, что путем химического взаимодействия на структуру фермента в его молекуле создаются новые ковалентные связи, в частности между белком и носителем. Препараты иммобилизованных ферментов, полученные с применением химических методов, обладают по крайней мере двумя важными достоинствами. Во-первых, ковалентная связь фермента с носителем обеспечивает высокую прочность образующегося конъюгата. При широком варьировании таких условий, как рН и температура, фермент не десорбируется с носителя и не загрязняет целевых продуктов катализируемой им реакции. Это особенно важно при реализации процессов медицинского и пищевого назначения, а также для обеспечения устойчивых, воспроизводимых результатов в аналитических системах. Во-вторых, химическая модификация ферментов способна приводить к существенным изменениям их свойств, таких как субстратная специфичность, каталитическая активность и стабильность. Химическая иммобилизация ферментов является искусством, уровень которого определяется, в первую очередь, умением экспериментатора. Основная задача экспериментатора заключается в формировании новых ковалентных связей в молекуле фермента при использовании его функциональных групп, несущественных для проявления его каталитической активности. При химической модификации фермента его активный центр желательно защищать. При сопоставлении различных приемов иммобилизации химические методы для крупномасштабных биотехнологических процессов кажутся малопривлекательными из-за сложности и дороговизны. В промышленных процессах обычно используются те или иные методы физической иммобилизации.

 

 

Ферментные электроды.

 

Классический потенциометрический ферментный электрод представляет собой комбинацию ионно-селективных электродов (ИСЭ) с иммобилизованным (нерастворимым) ферментом, который обеспечивает высокую селективность и чувствительность определения конкретного субстрата. Достоинством таких потенциометрических сенсоров являются простота оборудования (требуется только рН-метр), низкая стоимость, доступность большого числа хороших и надежных базовых ИСЭ. Концепция «растворимого» ферментного электрода впервые была выдвинута Кларком и Лайонсом в 1962 г. Однако лишь в 1971 г. был создан первый ферментный электрод на основе глюкооксидазы, иммобилизованной в геле на поверхности полярографического кислородного электрода, который позволяет определять глюкозу в биологических жидкостях и тканях. Ферментные электроды могут работать и как вольтамперометрические, и как амперометрические датчики, то есть измеряется ток при приложенном постоянном напряжении. В 1969 г. Гилболт и Монталв предложили первый потенциометрический (измеряется потенциал системы без наложения внешнего напряжения) ферментный электрод для определения мочевины. В ферментных электродах ферменты обычно иммобилизуют, что позволяет уменьшить расход материалов для проведения анализов и исключить частую проверку ферментного препарата для получения воспроизводимых результатов. Кроме того, устойчивость фермента часто увеличивается при введении его в подходящий гелевый носитель. Например, электрод для определения мочевины с химически связанной уреазой на поверхности аммонийного ИСЭ может работать более 300 дней. Для иммобилизации фермента используют два метода: химическую модификацию фермента введением групп, снижающих его растворимость, и физический захват фермента инертным носителем, например крахмалом или полиакриламидом. Для изготовления электродных датчиков более всего подходит химическая иммобилизация. Функционирование ферментного электрода можно рассматривать как пятистадийный процесс, включающий:

1. подвод субстрата к поверхности электрода;
2. диффузию субстрата через мембрану активного центра;
3. реакцию в активном центре;
4. перенос продукта ферментативной реакции через мембрану к поверхности электрода;
5. определение продукта вблизи поверхности электрода.

Первая стадия – подвод субстрата – сильно зависит от скорости перемешивания раствора. Интенсивное перемешивание обеспечивает быстрый перенос субстрата к поверхности электрода. Если сделать мембрану очень тонкой и использовать высокоактивный фермент, то 2-я и 4-я стадии исключаются или оказывают минимальное влияние. Стадия 3 также является очень быстрой, поэтому время отклика ферментного электрода теоретически должно быть близким к времени отклика базового электрода. Многие исследователи приводят экспериментальные данные, показывающие, что это достижимо при использовании тонкой мембраны и быстром перемешивании.

 

Применение ферментных электродов.

 

Ферментные электроды представляют собой биосенсоры, которые позволяют быстро и селективно проводить определение целого ряда компонентов в сложных по составу объектах. На основе использования ферментов созданы различные экспресс-тесты. Многие из них чрезвычайно просты. Например, тест-устройство для определения токсичных фосфорсодержащих пестицидов в продуктах питания представляет собой бумажную полоску, один конец которой пропитан раствором хромогенного субстрата, а второй содержит иммобилизованную холинэстеразу. При анализе концы полоски совмещают и обмакивают в воду или в выжатый из фруктов или овощей сок. Т. к. пестициды в больших, чем предельно допустимых концентрациях (ПДК), количествах ингибируют холинэстеразу, то отсутствие окраски свидетельствует о превышении ПДК пестицидов.

Аналогичные бумажные тесты предложены для определения глюкозы в моче и крови. Широкое распространение получают иммуноферментные методы – разновидность иммунных методов анализа (радиоактивная или флуоресцентная метка заменяется ферментом). Их используют для определения иммуноглобулинов, гормонов, стероидов, лекарственных средств, пестицидов. Эти методы обладают исключительно высокой чувствительностью. Для повышения воспроизводимости, экспрессности и производительности в ферментном методе анализа применяют автоматические анализаторы разного типа. Каталитические реакции с участием растворимых и иммобилизованных ферментов, а также ферментных реакторов все чаще используют в проточно-инжекционном анализе. Ферментный метод анализа применяют в химическом анализе, но по сравнению с другими методами анализа, недостаточно широко. Из более чем 1800 полученных ферментов используют около 50.