Метод меченых атомов

Проточный жидкосцинтилляционный детектор для регистрации высоких потоков нейтронов.  Концентрация флуоресцирующего вещества обычно мала и регистрируемая частица возбуждает в основном молекулы растворителя.  В дальнейшем энергия возбуждения передается молекулам флуоресцирующего вещества.  Широко развивается техника жидкостно-сцинтилляционных измерений,  при которых препараты радиоактивных веществ вводятся  (растворяются,  эмульгируются и т.п.)  непосредственно в жидкостно- сцинтилляционную смесь,  что обеспечивает простоту приготовления препаратов,  выгодные геометрические условия измерений, исключает потери, связанные с ослаблением излучения.   Так как в органических сцинтилляторах возбуждаются молекулярные уровни,  которые излучают в ультрафиолетовой области для согласования со спектральной чувствительностью регистрирующих светустройств (ФЭУ и фотодиодов) используются светопреобразователи, которые поглощают ультрафиолетовое излучение и переизлучают видимый свет в области 400 нм.  Газовые сцинтилляторы. При прохождении заряженных частиц через различные газы в них наблюдалось появление сцинтилляций. Наибольшим световым - выходом обладают тяжелые благородные газы (ксенон и криптон).  Большим световым выходом обладает также смесь ксенона и гелия.  Присутствие в гелии 10%  ксенона обеспечивает световой выход,  даже больший,  чем у чистого ксенона.  Ничтожно малые примеси других газов резко уменьшают интенсивность сцинтилляций в благородных газах.  Для исследования заряженных частиц малых энергий (< 0,1 Мэв) и осколков деления ядер в качестве сцинтилляторов применяются газы  (Табл.  ),  в основном -  инертные газы (Xe, Kr, Ar, He),  из которых основным является ксенон.  В этом случае катод фотоумножителя помещается в соответствующий светоизолированный газонаполненный объём. Измеряемый радиоактивный объект помещается также в этот газонаполненный объём.  Спектры излучения этих благородных газов находятся в фиолетовой области спектра.  Экспериментально было показано, что длительность вспышек в благородных газах мала (10 -9 -10 -8  сек), а интенсивность вспышек в широком диапазоне пропорциональна потерянной энергии регистрируемых частиц и не зависит от их массы и заряда. Газовые сцинтилляторы обладают малой чувствительностью к γ- излучению.  Газы обладают линейной зависимостью величины сигнала от энергии частицы в широком диапазоне энергий,  быстродействием и возможностью менять тормозную способность изменением давления.  Кроме того, источник может быть введён в объём газового сцинтиллятора. Однако газовые сцинтилляторы требуют высокой чистоты газа и специального ФЭУ с кварцевыми окнами  (значительная часть излучаемого свет лежит в ультрафиолетовой области). 

 

 

 

4 Введение радиоактивной  метки в биологический препарат: in vitro и in vivo

 

 

Если синтез белка или  нуклеиновой кислоты ведут в  полной ферментативной системе in vitro (в пробирке) с использованием радиоактивно меченых низкомолекулярных предшественников, то оценить включение радиоактивности в биополимер можно с использованием счета радиоактивности конечного продукта на фильтре. Для задержания белков или нуклеиновых кислот после осаждения их из реакционной смеси трихлоруксусной кислотой (ТХУ) или этанолом можно использовать фильтры из толстой фильтровальной бумаги или стекловолокна с размером пор 0,45-1,2 ц. Второй вариант предполагает использование имеющихся в продаже мембранных фильтров из нитроцеллюлозы (без осаждения). В этом случае задержание продукта реакции на фильтре обусловлено его сорбцией. Нитроцеллюлоза прочно сорбирует щелочные белки, рибосомы и однонитевые (денатурированные) молекулы ДНК. Следует отметить, что в случае использования бумажных или стекловолокнистых фильтров часть радиоактивного продукта проникает в глубь фильтра, а на мембранном - весь он тонкой пленкой распределяется по поверхности. С точки зрения надежного контакта со сцинтиллятором второй вариант предпочтительнее. Но мембранные фильтры намного дороже бумажных или стекловолокнистых. Для данной цели удобны фильтры диаметром 24 мм, что позволяет легко вносить их во флаконы сцинтилляционного счетчика.

В колбу Бунзена  вставляют  на резиновой пробке кольцевую подложку для фильтра  из нержавеющей стали в виде решетки с кольцевым шлифованным фланцем. На нее кладут фильтр , а на фильтр ставят резервуар, выточенный из такой же стали и тоже со шлифованным фланцем. Фланцы сжимают пружинными зажимами. Такая легко разборная конструкция удобна для манипуляций с фильтром.

В резервуар заливают реакционную  смесь со взвешенным в ней осадком исследуемого продукта (в первом варианте) или без осадка (во втором варианте) и при небольшом разрежении отсасывают жидкость. Радиоактивные предшественники вымывают 5-6 раз сменяя в резервуаре промывную жидкость, не способную растворить осадок. (Например, ту же, в которой велось осаждение полимера)

Если фильтров много, то, пронумеровав их предварительно по краю карандашом, можно промывку вести "в  объеме", большими партиями, сменяя промывную жидкость каждые 15 минут  и периодически встряхивая ее. Последние  промывки в любом случае ведут  этанолом, затем эфиром для полного  удаления воды во время последующей  сушки фильтров. Это особенно важно  для "объемных": бумажных и стекловолокнистых  фильтров, где вода должна быть полностью  удалена из внутренних пор, так как  просчет радиоактивности осадка на фильтре ведут во флаконе с  чистым толуоловым сцинтиллятором. Остатки воды в порах могут преградить сцинтиллятору доступ к радиоактивному веществу. Хорошо высушенный фильтр в толуоловом сцинтилляторе выглядит однородно полупрозрачным. Сушку ведут на воздухе при комнатной температуре 15-20 минут (до исчезновения запаха эфира). Положение "объемного" фильтра во флаконе, - лежа на дне или стоя на ребре, - не играет существенной роли. Вспышки света при испускании (3-электронов все равно "засвечивают" всю жидкость во флаконе и будут замечены обоими ФЭУ. Впрочем, мембранный фильтр, все-таки, лучше положить на дно пленкой вещества вверх.

В случае малых объемов  инкубационной смеси даже в первом варианте использования фильтров не обязательно проводить реакцию  и осаждение полимера в объеме для последующего сбора осадка фильтрованием. До 50 мкл реакционной смеси можно просто нанести на бумажный фильтр и дать жидкости впитаться. Эту операцию можно провести за один прием для нескольких десятков пронумерованных фильтров, ряд за рядом наколотых булавками на слой резины, так чтобы они ее не касались. Затем резину с фильтрами помещают во влажную камеру, термостатированную при температуре ферментативной реакции. По ее окончании фильтры вместе с булавками снимают и помещают в большой стакан, заполненный 5%-ным раствором ТХУ или этанолом. Осаждение полимера будет происходить внутри фильтров. (С булавок фильтры снимать не следует, так как булавки предохраняют их от слипания) Там же, в стакане производят и все промывки. Затем фильтры снова накалывают на резину, сушат и помещают во флаконы со сцинтиллятором в порядке их номеров.

Разумеется, при использовании  фильтров эффективность счета снижается  по сравнению с просчетом препарата, растворенного в сцинтилляторе. Некоторая часть энергии (3-электронов теряется на соударения с материалом осадка и пространственной сеткой фильтра. Однако Р-электрон, потерявший часть энергии, вовсе не обязательно уже неспособен вызвать световую вспышку в сцинтилляторе. А для счета важно только число импульсов в минуту, а не их амплитуда (за исключением счета двойной метки). Тем не менее, следует контролировать тормозящие факторы - толщину и плотность осадка, а также и самого фильтра, с тем, чтобы по возможности уменьшить число импульсов, оказавшихся не просчитанными из-за слишком большой потери энергии по дороге к сцинтиллятору.

In vivo.

Проще всего предоставить непростую, а иногда и небезопасную операцию введения метки самой природе. Для этого в питательную среду  вносят радиоактивно меченый предшественник синтеза интересующего нас вещества в организме. Проще всего это  сделать для бактерий. Меченый  по тимидин за 1 час легко включается в ее ДНК до уровня, составляющего около 10% внесенной в среду радиоактивности. Точно так же метят ДНК в животных клетках, растущих в культуре ткани.

Импульсную метку в  иРНК бактерий осуществляют путем введения в питательную среду С-урацила или того же Р-ортофосфата - после исчерпания или отмывки нерадиоактивного фосфора. Ввиду быстроты протекания процессов метаболизма у бактерий продолжительность такого импульса должна быть небольшой (10-30 сек.). После чего жизнедеятельность бактерий надо немедленно прекратить, например, вылить их суспензию на мелко раздробленный лед, содержащий азид натрия.

Метку в бактериальные  белки, как и в белки высших организмов в культуре клеток, удобнее  всего вносить с помощью меченого по С или S метионина. Напомню, что метионин является незаменимой аминокислотой (т.е. не синтезируется в самом организме) для клеток всех высших животных и некоторых бактерий. Кроме того, с него начинается синтез любого белка, что позволяет следить за началом этого процесса.

Введение метки через  диету животных практически не используется, так как радиоактивные изотопы  по путям метаболизма включаются во многие биологические молекулы. Кроме того разбавление радиоактивной  метки происходит за счет собственных  запасов организма, например, незаменимых  аминокислот, полученных в результате катаболизма (расщепления) собственных  белков. Все это требует большого расхода дорогостоящих радиоактивных  препаратов и связано с повышенной степенью радиационной опасности.

Здесь уместно заметить, что радиоактивная метка вводится, точнее сказать, создается в аминокислотах, нуклеотидах и других биологических  значимых молекулах путем специального облучения в атомных реакторах. Каталоги специализированных зарубежных фирм содержат многие сотни наименований радиоактивно меченых молекул. Чего, к сожалению, нельзя сказать об отечественной  продукции

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Заключение

 

 

Метод меченых атомов широко используется в современном мире. Его применяют для решения как фундаментальных, так и прикладных биологических проблем, изучение которых другими методами затруднено или невозможно. Существенное для биологии преимущество метода меченых атомов состоит в том, что использование изотопных индикаторов не нарушает целостности организма и его основных жизненных отправлений. С применением меода меченных атомов связаны многие крупные достижения современной биологии, определившие расцвет биологических наук во  2-й половине 20 в.

Трудно переоценить его  значение. Он применяется в разных областях науки и техники и  позволяет глубже и полней познать  законы природы, облегчить труд человека и спасти сотни тысяч людей от преждевременной смерти.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Список использованных источников

 

1. Авдонин П.В., Ткачук В. А, Рецепторы и внутриклеточный кальций. 1994. - Наука, Москва. - С.29-42.
2. Авцын А.П., Жаворонков А.А., Риш М.А., Строчкова Л.С. Микроэлементы человека, Медицина. М. - 1991.
3. Гааль, Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М.: Мир, 1982.
4. Гекселер К., Экштайн Э. Аналитические и препаративные лабораторные методы. М.: Химия, 1994.
5. Дарбре А. Практическая химия белка. М.: Мир, 1989.
6. . Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985.
7. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и центрифугирование. М.: Наука, 1981.
8. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М.:МЦНМО, 2002.
9. Практикум по биохимии. Под редакцией С.Е.Северина и Г.А.Соловьёвой. М.: Издательство МГУ, 1989
10. http://www.bibliotekar.ru/spravochnik-181-3/23.htm
11. http://mikroorganizmy.ru/azot-v-udobrenii/metod-mechenyx-atomov.html