Основы технологии, процессы и аппараты биотехнологических производств

    В качестве  субстратов,  используемых   для   культивирования микроорганизмов на твердых питательных средах, применяют, как правило, нестандартное сырье - различные  отходы  пищевой промышленности.  Среди них наиболее часто используют пшеничные  отруби,  свекловичный жом, проросшие ячменные зерна (солод), шелуха от некоторых  сельско- хозяйственных  культур  (риса,  гречихи,  подсолнуха).  В   качестве разрыхлителя субстрата часто используют древесные  опилки.  Все  эти виды субстратов отличает низкое содержание  азотсодержащих  веществ, поэтому в качестве добавок  к  ним  добавляют  такие  азотсодержащие соли, как сульфат  аммония  и  различные  добавки  микроэлементов  и ростовых факторов.

    Перед использованием  готовый  субстрат  подвергают  тщательной стерили-зации,  чтобы  обеспечить   максимально возможное подавление   посторонней микрофлоры. Микробиологический контроль при  этом  обычно  ведут  по наличию спор бактерий, так  как  именно  они  наиболее  устойчивы  к различным методам стерилизации. Наиболее часто стерилизацию проводят обработкой острым паром (более 120 С). Однако это часто  приводит  к комкованию  среды, что резко ухудшает процесс стерилизации таких комков на всю глубину,  и кроме того,  этот  процесс   является  весьма длительным, энерго- и материалоемким. Поэтому на ряде производств в последнее время стали использовать  для стерилизации  принципиально другие методы, например уничтожение микроорганизмов γ-  или рентгеновскими лучами.

Выращенный  в  отделении  «чистой»  культуры  посевной  материал перед  засевом  подвергают  микробиологическому   и   биохимическому контролю на отсутствие  посторонней  микрофлоры  и соответствие  его  паспортным  технологическим  данным.  Посевной  материал   считается пригодным для засева основных аппаратов, если  он  обеспечивает  при нормальной длительности культивирования  на  производственной  среде необходимое по паспорту  накопление  целевого  продукта  или  нужную ферментативную активность.

Поскольку практически  все  продуценты  культивируемые  поверх- ностным способом являются аэробами,  то  им  для  дыхания  необходим интенсивный подвод воздуха.

Очистка используемого воздуха  и его стерилизация  осуществляется  с использованием волокнистых  фильтрах.   Перед   растительными   камерами    всегда устанавливают кондиционеры для поддержания необходимой температуры и влажности. В связи с использованием воздуха в качестве теплоносителя расход его  достигает  значительной  величины.  Поэтому  практически любая  технологическая  схема  подготовки  и  циркуляции  воздушного потока предусматривает  его  рецикл,  в  котором  участвует  до  90% воздуха.   При  этом   циркулирующий    воздух    проходит    через воздухоохладитель,  а   часть отработанного воздуха   очищается   на   фильтрах   от пыли и микробных клеток, а затем выбрасывается в атмосферу.

Проблема регулирования  теплообмена в  процессе  культивирования имеет не менее важное значение, чем обеспечение подвода  воздуха.  В ходе  своего  роста  большинство   культур   выделяют   значительное количество тепла. В то же время известно, что  уже  при  температуре 38-40 С наступает угнетение вегетативного развития многих культур, а при 43-45 С  может  происходить  полная  инактивация  их  ферментных систем. Проблема усложняется тем,  что  выделение  тепла  в  течение всего периода культивирования происходит  неравномерно.  В начале культивирования выделение тепла обычно в  10-20  раз  больше  чем  в конце  процесса.  Поэтому необходим постоянный контроль за температурой внутри ростовой камеры и эффективный отвод избыточного тепла.

Решение проблемы теплообмена существенно упрощается благодаря тому, что так же неравномерно в ходе культивирования  происходит и потребление кислорода (воздуха),  при этом максимум потребления кислорода совпадает с максимумом тепловыделения.  В конце культивирования   потребление   кислорода становится  минимальным, одновременно уменьшается и выделение тепла. Это позволяет использовать холодный воздух, подаваемый в ферментер для съема и отвода выделяющегося в ходе культивирования тепла.

В процессе  культивирования  наблюдается  непрерывное  снижение влаги в твердом субстрате. В начале процесса  влажность  питательной среды достигает 58-60%, к моменту окончания  процесса  эта  величина может снизиться до  уровня  30%.  Это  отрицательно  сказывается  на развитии микроорганизма и как следствие на выходе целевого продукта.  Поэтому для производственных условий важно в течении  всего  времени культивирования поддерживать величину влагосодержания на  уровне  не ниже 55-50%, что достигается предварительным увлажнением (кондиционированием) воздуха, подаваемого в растительные камеры..

Способы поверхностного культивирования

В  современном  производстве  используются,  в  основном,   три способа  поверхностного  культивирования  микроорганизмов:  кюветный способ  выращивания,  касетный  способ  выращивания  и   выращивание методом объемной аэрации.

Кюветный  способ является наиболее распространенным, особенно  в малотоннажных производствах. Лотки-кюветы после загрузки  субстрата, засеянного соответствующей культурой микроорганизма,  помещаются  на стелажи в специальные растительные камеры в которых  поддерживаются все необходимые для культивирования условия. Такой процесс  является малопроизводительным  и  весьма  трудоемким,  поскольку  большинство технологических операций по загрузке и выгрузке выполняются вручную.

С  целью   интенсификации  процессов   кюветного   выращивания разрабатываются конструкции растительных камер в которых кюветы  по басконечной конвеерной  ленте   движутся   через   различные   зоны раститель-ной камеры, в которых поддерживаются  условия  (теплообмен, воздухообмен, влажность и др.) соответствующие тем или иным  стадиям роста  микро-организма.  После  прохождения  камеры  кюветы  проходят отделения сушки, съема готовой культуры, мойки, стерилизации и снова подаются на загрузку.

Касетный  способ  выращивания   продуцента   осуществляется   в специальных растительных  камерах,  имеющих  форму  параллелепипеда.  Камера разделена на 23 секции-касеты перфорированными  перегородками с двойными стенками, между которыми подается  стерильный  воздух.  В пространство  между  перегородками   загружают   сверху   засеянную питатель-ную среду. Днище касеты состоит из двух жалюзийных  пластин.  Стерильный  воздух  подводится  к  каждой  из   секций   с   помощью коллектора.

По окончании  процесса культивирования камеру  разгружают  путем открытия   жалюзийных пластин днища   камеры.   Полнота   разгрузки    камеры обеспечивается путем установки ее на специальный вибростол.

Касетный способ выращивания позволяет вдвое  увеличить  толщину слоя субстрата, по  сравнению  с  кюветным, благодаря двустороннему обдуву его потоком воздуха,  что ведет к повышению эффективности процесса поверхностного культивирования.

Процесс культивирования методом  объемной  аэрации  проводят  в специальных колонных аппаратах,  разделенных по  высоте  на  секции перфорированными пластинами, укрепленными на поворотных осях. Воздух с помощью коллектора  подают  под каждую   секцию   аппарата,   а выделяющееся в ходе ферментации тепло отводят охлаждающей водой, подаваемой  в   наружную   рубашку аппарата.   Питательная   среда дополни-тельно перемешивается и распределяется по тарелкам с  помощью установленных  по  центру  аппарата  на  общем  валу  перемешивающих устройств. Загрузка аппарата осуществляется сверху, а выгрузка через днище. При этом перегрузка среды с тарелки на  тарелку и выгрузка осуществляется в результате поворота сегментных  частей  тарелок на угол 90  в автоматическом режиме.

ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ЦЕЛЕВЫХ  ПРОДУКТОВ

По  окончании  процесса  культивирования  необходимо   выделить целевой продукт, отделив его от биомассы микроорганизма  и  частичек субстрата. Если целевыми продуктами  являются  простые  органические соединения  (кислоты.  витамины,  антибиотики  и  др.)  то  для   их выделения применимы большинство стандартных методов  используемых  в химической  и  фармацевтической  промышленности.  При  этом   обычно сначала субстрат с выросшей на нем биомассой измельчают,  если  надо сушат,  и  подвергают  экстракции   соответствующим   растворителем.  Растворитель упаривают и далее в зависимости от  физико-химических свойств продукта его дополнительно очищают тем или иным  способом (перегонка, возгонка, перекристаллизация, хроматографическое  разделение и др.). Наиболее трудоемкой и экологически вредной является процедура измельчения частиц твердого субстрата, которая требует использования громоздких и энергоемких аппаратов дробилок и сопровождается образованием большого количества алергенной  пыли.

Если целевым  продуктом являются белковые соединения (ферменты), то выбор методов и режимов выделения более ограничен. Это связано  с тем, что ферменты, являясь веществами белковой природы, могут  легко подвергаться денатурации под воздействием таких факторов, как высокие (выше 70⁰С) и низкие (ниже 0⁰С) температуры, значения рН  среды,  не отвечающее оптимуму действия ферментов, наличие  реакционноспособных химических соединений, способных вступать  в  реакции  и  необратимо инактивировать ферменты. Более подробно технология выделении ферментных препаратов приведена в методическом указании “Методы выделения и очистки продуктов биотехнологических производств”.

ГЛУБИННОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ

       По сравнению с рассмотренным нами ранее поверхностным  способом культивирования  микроорганизмов  глубинный  способ  культивирования имеет ряд существенных преимуществ: при его  использовании  возможно менять  состав  питательной  среды  в  широком  интервале   значений концентраций различных компонентов, добиваясь при этом максимального выхода  целевого  продукта   с   единицы   объема   ферментационного оборудования, в  технологическом  процессе  значительно  сокращается доля ручного труда (транспортировка питательной среды, загрузка и разгрузка аппарата)  он  требует меньших затрат  на  организацию процесса автоматизации различных стадий,  предлагает более простую последующую переработку биомассы микроорганизмов с целью выделения и очистки готового продукта.

     Рассмотрим  принципиальную  технологическую  схему   глубинного  культивирования микроорганизмов  на рис.1.

     Рис.1  Принципиальная технологическая схема глубинного культивирования микроорганизмов.

     1 - смеситель питательной  среды; 2 - колонка для непрерывной стерили     зации потока питательной среды; 3 - теплообменник - выдерживатель;     4 - теплообменник для охлаждения потока питательной среды; 5 - инокуляторы (или посевные аппараты); 6 - индивидуальный фильтр для очистки      воздуха; 7 - ферментер; 8,9 - насосы; масляный фильтр для предварительной очистки воздуха; 11 - компрессор; 12 - головной фильтр для очистки воздуха.

Для  любого  биотехнологического  процесса   существует множество вариантов организации производства на промышленном  уровне. Однако все процессы можно разделить на две большие группы -  периодические и непрерывные.

 При  периодическом  способе  производства простерилизованный ферментер заполняется питательной средой,  часто уже   содержащей   нужные микроорганизмы.   Биохимические   процессы   в    этом    ферментере продолжаются от нескольких часов  до  нескольких  дней. При этом типе культивирования клеточная культура может пройти все фазы своего развития:

1) Lag-фазу, или фазу задержанного роста, при которой клетки растут медленно и адаптируются к новой среде обитания в объеме ферментера;

2)   фазу ускорения – когда  адаптация закончилась и клетки  начинают интенсивно делиться

3) Log-фазу, характеризующаяся интенсивным делением клеток и сбалансированностью роста всей популяции;

4) фазу замедленного роста, связанную с исчерпанием питательных субстратов и накоплением токсических продуктов метаболизма;

 5) Const- фазу или стационарную фазу, при которой прирост новых клеток количественно равняется числу погибающих;

6) фазу отмирания, характеризующуюся прогрессирующей гибелью клеток.

Синтез первичных метаболитов  наиболее интенсивно идет с середины  Log-фазы до середины стационарной. Ближе к концу стационарной фазы может начаться синтез вторичных метаболитов.

 Периодически ферментер опорожняют, моют, стерилизуют, целевой продукт отправляют на очистку, и начинают  новый цикл.

Системы, функционирующие  в таких условиях, характеризуются  как batch-системы (замкнутые системы). Большинство современных биотехнологических систем функционируют как batch-процессы, при которых однажды оптимизированные условия обеспечивают максимальное накопление целевого (требуемого) продукта.

 При непрерывном  способе  подача равных объемов сырья (питательных веществ)  и   отвод   культуральной жидкости, содержащей клетки продуцента и целевой продукт осуществляется одновременно. Такие ферментационные системы характеризуются как открытые. Через некоторое время после начала процесса в таком ферментере устанавливается динамическое равновесие между процессами размножения клеток с одной стороны и процессами отмирания и вымывания живых клеток их аппарата с другой. В результате концентрация клеток устанавливается на определенном уровне, задаваемом технологическим режимом (скоростью протока, количеством питательных веществ, температурой). Теоретически такая сonst-фаза, при неизменных параметрах процесса культивирования  может поддерживаться бесконечно долго. Ферментер, работающий в таком режиме, значительно более прост в управлении, по сравнению с аналогичным, работающим в периодическом режиме. Это обусловлено тем, что при постоянстве концентрации клеток продуцента постоянными являются и все их потребности (питательные вещества, воздух) и параметры процесса (тепловыделение, уровень рН, выделение целевого продукта).

Принцип непрерывного проточного культивирования  похож на непрерывные процессы в  химической технологии и подобно  им  может реализовываться по двум основным схемам: