Химико-токсикологическое определение при отравлении цитостатистиками

Идентификацию веществ  на хроматограммах проводят по коэффициенту Rf (скорость фракционирования).

Rf – это величина, численно равная отношению длины пробега анализируемого вещества к длине пробега растворителя:

 Rf = Нв-ва / Нраств.

Rf является константой  вещества в заданных хроматографических  условиях при их строгом соблюдении. На практике соблюдение всех  условий затруднено. Величина Rf может колебаться в зависимости от целого ряда факторов:

- техники выполнения  работы,

- качества и активности  сорбента,

- толщина слоя сорбента,

- чистоты растворителей,

- степени насыщения  камеры парами растворителей,

- температуры,

• присутствия балластных веществ и проч.

 

Поэтому иногда принято  пользоваться не абсолютным, а относительным  значением Rf, которое обозначается как Rst.

Относительный коэффициент Rst. численно равен отношению абсолютной величины Rf исследуемого вещества к Rf метчика:

Rst = Rf в-ва / Rf метчика

В качестве метчика используется вещество, принятое за стандарт. Относительное  значение Rf более воспроизводимо, т.к. с изменением хроматографических условий  меняются значения Rf исследуемого веществ  и вещества-стандарта, а их соотношение остается достаточно стабильным. При совпадении величин Rf исследуемого веществ и вещества-стандарта можно предположить их идентичность. В условиях скрининга Rf исследуемого вещества сравнивают с табличными данными, полученными в аналогичных условиях.

Метод ТСХ широко распространен  благодаря своей доступности  и простоте выполнения, и в то же время высокой эффективности, чувствительности, экспрессности, достаточной  специфичности.

ТСХ применяется в  системе общего и частного скрининга и разработана для многих лекарственных веществ, имеющих токсикологичское значение.

В общем скрининге  используется множество систем растворителей, из них можно выделить некоторые:

1. Для веществ кислого,  нейтрального и слабоосновного  характера, извлекаемых органическим растворителем из кислого водного раствора – хлороформ:ацетон (9:1).

2. Для веществ основного  характера, извлекаемых органическим  растворителем из щелочного водного  раствора: диоксан:хлороформ:ацетон:25% раствор аммиака (47,5:45:5:2,5), ацетон:хлорофром:25% раствор аммиака (245:12:1).

3. При анализе наркотических и других одурманивающих веществ, при

 

экспресс-анализе острых отравлений используют универсальную  систему толуол:ацетон:этанол:25% раствор  аммиака (45:45:7,5:2,5).

Для детектирования веществ  на хроматографической пластинке разработана  схема последовательного их проявления.

Для веществ кислого, нейтрального и слабоосновного характера:

- УФ-облучение,

- дифенилкарбазон в  хлороформе и раствор сульфата  ртути: проявляются производные барбитуровой кислоты;

- раствор хлорида железа  трехвалентного: проявляются производные  пиразолона, салициловой кислоты,  фенотиазина;

- реакив Драгендорфа  и 0,5 М серная кислота: проявляются  азотсодержащие вещества слабоосновного  характера.

Для веществ основного характера:

- УФ-облучение,

- раствор хлорида железа  трехвалентного: проявляются производные  пиразолона, фенотиазина;

- раствор натрия нитрата  в кислоте хлорной: проявляются  производные фенотиазина, тиоксантены;

- реакив Драгендорфа  и 0,5 М серная кислота: проявляются азотсодержащие вещества основного характера.

Отдельная пластинка: реактив  Марки (концентрированная кислота  серная, содержащая 10% формалина): проявляются, в частности алкалоиды группы опия, дифенгидрамин, некоторые производные фенотиазина и др.

При обнаружении веществ  в общих системах переходят к  исследованию в частных системах растворителей.

Например:

Для барбитуратов – хлороформ:н-бутанол:25% раствор аммиака (70:40:5).

Для алкалоидов опия –  этилацетат:метанол:25% раствор аммиака (17:2:1).

 

Разработанная методика проста, универсальна, может быть использована в клинико-диагностических лабораториях и Бюро судебно-медицинской экспертизы.

С помощью ТСХ можно  определять вещества в количествах  от 10-9 до 10-6 г, ошибка определения компонентов – 5-10 %.

Воспроизводимость результатов  исследования методом ТСХ достигается  проведением их при следующих  условиях:

1.      Инструментальные  условия проведения эксперимента, которые включают конструкцию  используемой хроматографической камеры; способ ее герметизации; условия насыщения камеры парами растворителя и т.д.

2.      Свойства  хроматографической системы, которые  включают тип и способ химической  обработки использованного сорбента; величину его зернения; толщину  слоя, а также тип подложки, на которую он нанесен; вид и количество внесенных в адсорбент вспомогательных веществ, таких как связующие компоненты и флуоресцирующие вещества; метод активации сорбента, например, выдерживание при повышенной температуре; способ обработки пластинки импрегнирующими буферами, щелочами или кислотами, а также веществами, модифицирующими ее свойства.

 3.   Методические подходы к нанесению пробы и проведению хроматографирования, которые предусматривают способ нанесения образца на пластинку и использованное при этом устройство; размер начальной зоны хроматографирования; полярность растворителя, использованного для нанесения образца и его количество; продолжительность исследования и величину пробега растворителя; его состав и чистоту; температуру и влажность окружающей среды в момент проведения исследования.

Представление результатов  исследований. В экспертном заключении полученные рассматриваемым методом  результаты должны содержать подробное  описание условий проведения эксперимента: хроматографические

 

пластины (адсорбент, наличие  или отсутствие индикатора в его  составе, использованное связующее  вещество, тип подложки для адсорбента, фирма – изготовитель, а также  проведение специальной обработки  пластин перед исследованием, например, высушивание при повышенной температуре или импрегнирование щелочью или буфером). Схема обработки хроматографических пластин должна содержать описание использованных реактивов с их полным качественным и количественным составом, последовательности проведения этапов обработки, их интенсивности и продолжительности. Особо отмечается интенсивность и окраска хроматографических зон исследуемых веществ после обработки каждым реактивом, а также величина их Rf или RRf. При проведении подтверждающих исследований на конкретное вещество допускается указание о том, что в данных конкретных условиях величина Rf и окраска хроматографической зоны исследуемого вещества использованными реактивами совпадает с величиной Rf и окраской стандартного раствора - метчика. В заключении приводятся также данные о пределе обнаружения метода.

5.1.2. Высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ)

 

ВЭТСХ появилась в  начале 70-х г.г. прошлого столетия как  новое направление в ТСХ. Имеет  ряд преимуществ по сравнению  с ТСХ:

ü    более высокая  эффективность (за 1 прием можно разделить около 40 веществ),

ü    высокая чувствительность и экспрессность.

Высокая эффективность  данного метода достигается за счет применения высокодисперсного сорбента, а более высокая чувствительность и экспрессность – более тонкого слоя сорбента (10-15 нм).

В качестве сорбентов  применяются силикагель, окись алюминия,

 

целлюлоза, метилцеллюлоза, полиамид, инактивированный силикагель и др.

Методы хроматографирования  существенно не отличаются от ТСХ. Методы детектирования идентичны, только более чувствительны. Возможно проведение количественного анализа с применением метода сканирующей денситометрии, дающей точные результаты и не требующей элюирования веществ с пластинки.

ВЭТСХ, так же как и  ТСХ, сочетают с другими физико-химическими методами анализа – спектральными, ГЖХ, ВЭЖХ, что повышает надежность исследования.

 

 5.1.3.  Газожидкостная хроматография (ГЖХ)

ГЖХ нашла свое применение в анализе лекарственных веществ  в качестве скринингового метода благодаря своей универсальности. Необходимым условием является переведение исследуемого вещества в летучее состояние. Метод используется при анализе барбитуратов, алкалоидов и других лекарственных веществ в качестве общего и частного скринингового.

Идентификация веществ проводится по относительным временам удерживания (или индексам удерживания Ковача). Количественное определение – по высоте (площади) пиков исследуемого вещества и вещества, применяемого в качестве внутреннего стандарта.

Достоверность исследований повышается при использовании не менее 2 колонок, обладающих различной полярностью. Используемые детекторы – пламенно-ионизационный, масс-селективный.

 

 5.1.4. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)

 

ВЭЖХ (жидкостная хроматография  высокого давления) является

 

вариантом колоночной хроматографии, где элюент подается в колонку  под высоким давлением, что ускоряет проведение анализа. Разделение веществ  проводится на колонках, заполненных  мелкодисперсным сорбентом.

При работе с колонками, заполненными силикагелем, в качестве элюента используются углеводороды, иногда с добавлением небольшого количества спирта или других растворителей (нормальнофазный вариант).

В обращеннофазном варианте к силикагелю прививают гидрофобную  фазу – обычно это углеводороды с большим числом углеродных атомов, например, С18, в этом случае в качестве элюента используются смеси метанола или ацетонитрила с водой или буферными растворами.

В качестве детекторов обычно применяют детектор с переменной (от 190 до 900 нм) или с фиксированной длиной волны. Могут быть использованы и другие детекторы – рефрактометрический, флуорометрический, ионизационно-пламенный, электрохимический, диодно-матричный, масс-селективный и т.п.

Выходящие из колонки  вещества регистрируются на хроматограмме в виде ряда хроматографических пиков. Идентификацию веществ проводят по параметрам удерживания (время выхода) и спектральным отношениям на разных длинах волн по отношению к опорной (базовой). Количественное определение проводится по площади пика исследуемого вещества, которая прямо пропорциональна количеству вещества в пробе. При этом предварительно строится калибровочный график с использованием методов абсолютной градуировки или внутреннего стандарта.

Метод ВЭЖХ может быть использован в качестве общего и частного скрининга. Он позволяет сочетать изолирование и очистку вещества с его идентификацией и количественным определением.

Значительным преимуществом  этого метода перед ГЖХ является возможность анализа термолабильных нелетучих соединений с малой и

 

большой молекулярной массой. Особенно удобен метод ВЭЖХ для работы в клинических лабораториях токсикологических  центров при исследовании билогических жидкостей.

 

 

 

5.2. Спектральные  скрининговые методы

Для скрининга лекарственных средств  могут быть применены:

           1.  Абсорбционная спектроскопия в видимой и УФ-областях спектра.

           2.   ИК-спектроскопия.

           3. Спектроскопия ЯМР (ядерного магнитного резонанса).

           4. МС (масс-спектрометрия).

Из перечисленных методов наиболее широко применяется метод абсорбционной спектроскопии в видимой и УФ-областях спектра. Это связано с его доступностью и в то же время достаточной информативностью, чувствительностью.

 

5.2.1. Абсорбционная  спектроскопия

 

Поглощение (абсорбция) веществом света, т.е. потока фотонов или электромагнитного излучения, в видимой или УФ-области спектра связано с переходом электронов внешних орбиталей (валентных электронов) из основного состояния (с меньшей энергией) в возбужденное состояние (с большей энергией). При этом энергия поглощенного фотона:

 

D Е = Е1- Е0, где

D Е – энергия  поглощенного фотона,

Е1 – энергия  электрона в возбужденном состоянии,

Е0 - энергия  электрона в основном состоянии.

 

                   D Е = h .v = h . c/ l, где                                                                             

h –постоянная  Планка,

v – частота  излучения,

v – скорость  света,

l - длина волны.

Поскольку h и c – величины постоянные, очевидно, что энергия поглощенного излучения  будет обратно пропорциональна l.

Согласно  хромофорно-ауксохромной теории избирательным  поглощением в видимой и УФ-областях спектра обладают вещества, имеющие  в своей структуре определенные группы атомов – хромофоры.

Хромофоры содержат одну или несколько кратных (двойных) связей или неподеленные пары электронов, например:

C=C – этиленовая  группа,