Физиология и биохимия растений. Ферменты

ФЕРМЕНТЫ

 

«Ферменты (Ф.) есть, так сказать, первый акт жизненной деятельности. Все  химические процессы направляются в  теле именно этими веществами, они  есть возбудители всех химических превращений. Все эти вещества играют огромную роль, они обуславливают собою те процессы, благодаря которым проявляется жизнь, они и есть в полном смысле возбудители жизни». И.П. Павлов.

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ. Ферменты или энзимы (fermentum – аска (лат.), rn – внутри, zyme – закваска (греч.) – биологические катализаторы, вещества белковой природы, ускоряющие течение биохимических реакций. Это рабочий аппарат клетки. Они обуславливают химизм клетки, а, следовательно, ее жизнь.

Клетка набита Ф. В одной клетке содержится 5х10⁸ …10⁹ молекул Ф. Для обнаружения фермента проводят качественную реакцию.

2. ЗНАЧЕНИЕ Ф.

Широко используют в промышленности, особенно в пищевой и перерабатывающей (более 200 Ф.);

В медицине для диагностических  тестов, в качестве лекарственных  препаратов;

С помощью их расшифрована химическая структура некоторых сложных органических молекул, например, инсулина. Это позволило наладить производство синтетического инсулина;

Широко используется в биотехнологии, при соматической гибритдизации;

Многие средства защиты растений применяются как ингибиторы ферментов. Ф. получают с помощью микробиологической индустрии. Искусственные Ф. создать пока не удалось.

В настоящее время иной становится и технология применения Ф. Их все чаще используют в иммобилизованном виде (иммобилизованные ферменты), т.е. молекулу ферментативного белка присоединяют почти без потери каталитических способностей к твердому носителю, например, полисахаридам. В таком виде Ф. сохраняется и функционирует в сотни и тысячи раз больше. Глюкозно-фруктозный сироп из кукурузного крахмала производят как раз с помощью иммобилизованных Ф.Фруктоза в 2 раза слаще сахарозы. Сахар в большом количестве вреден здоровью, а фруктоза – нет. Аспартам – малокалорийный заменитель сахара их 2-х аминокислот также получают с помощью иммоблизованных ферментов.

 

ОБЩИЕ И ОТЛИЧИТЕЛЬНЫЕ  СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ.

Являясь катализаторами, Ф. имеют ряд  общих свойств с небиологическими катализаторами.

Ф. не входят в состав конечных продуктов  реакции и выходят из акции в первоначальном виде. Они не расходуются в процессе катализа. Поэтому их необходимо отделять от конечных продуктов реакции.

Ф. не могут возбудить реакций, противоречащих законам термодинамики. Они ускоряют лишь те реакции, которые могут протекать  и без их.

Ф. не смещают положение равновесия реакции, а лишь ускоряют его достижение.

ОТЛИЧИТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ.

Каждый Ф. активно функционирует  лишь определенное время, а затем  его молекулы разрушаются. Время  полужихзни растительных ферментов  колеблется от 1 часа до нескольких суток. Поэтому Ф. в клетках растений интенсивно обновляются.

Ф. обладают более сильным каталитическим действием (в десятки и сотни раз).

Ф. обладают узкой специфичностью, т.е. избирательно действуют на субстраты. Один Ф. – одна реакция, или группа близких реакций. «Ф. подходит к субстрату, как ключ к замку» (Э. Фишер). Благодаря специфичности Ф. для биохимических реакций характерен почти 100 % выход продуктов и клетки работают как идеальные химические машины. Специфичность обуславливает также разобщенность б/х реакций в клетке, их несмешиваемость.

Регулируемость действия Ф. в клетке.

Высокая лабильность Ф. в клетке, т.е. зависимость их каталитического  действия от ряда факторов (температуры, рН, активаторов и ингибиторов). Это  связано с белковой природой ферментов.

Обратимость действия ферментов.

Например, липазы, катализируют как распад, так и синтез жиров.

СТРОЕНИЕ Ф.

Все Ф. подразделяются на две большие  группы: однокомпонентные и двухкомпонентные. Однокомпонентные Ф. состоят только из белка; 2-х компонентные – из белка  и связанной с ним небелковой части. Небелковая часть называется активной, или простетической группой, или коферментом. Белковая часть называется апоферментом. Каждый фермент имеет активный центр (АЦ). АЦ – часть Ф., с помощью которой соединяется Ф. с субстратом (S) и от которой зависят каталитические свойства Ф. АЦ занимает небольшую часть молекулы Ф. У однокомпонентных Ф. АЦ образуется определенными белковыми радикалами аминокислотных остатков, а у 2-х компонентных Ф. в него входят и некоторые группировки небелковой части.

1 – белковая часть – апофермент;

2 – небелковая часть (кофермент  или активная группа).

Однокомпонентный Ф. 2-х компонентный Ф.

Апофермент во много раз больше кофермента.

В состав коферментов могут входить:

Соединения нуклеотидного типа (НАД⁺; НАДФ⁺; ФАД и др.).

некоторые витамины. Например, витамин РР (никотиновая кислота) в составе  НАД⁺; НАДФ⁺; витамин В₂ – рибофлавин – в составе ФАД.

Металлы и металлсодержащие небелковые части. В настоящее время известно около 100 металлоферментов.

Наиболее часто в состав Ф. входят Zn, Cu, Fe, Mo. Например, каталаза (Fe), карбоангидраза (Zn), аскарбинатоксидаза (Cu), нитратредуктаза (Mo).

Другие небелковые части. Например, липоевая кислота.

Все небелковые компоненты Ф. имеют  сравнительно небольшую молекулярную массу и являются термосталбильными  по сравнению с апоферментом.

Однако большинство Ф. являются однокомпонентными. Свыше 200 из них  получены в чистом виде.

Есть и аллостерические Ф. Они имеют два центра: активный или каталитический и аллостерический. Они взаимосвязаны. Вещества, присоединяясь к алостерическому центру, вызывают изменение его формы и соответствующую перестройку активного центра, что влияет на скорость реакции. Такие вещества называются эффекторами. Они бывают положительными (ускоряют реакцию) и отрицательными (замедляют реакцию). Так регулируется активность ферментов по типу обратной связи

Механизм взаимодействия аллостерического взаимодействия фермента с эффектором:

1 – активный центр Ф.,

2 – аллостерический центр Ф.,

S – субстрат,

Э – эффектор.

Различают также конститутивные (КФ) и адаптивные ферменты (АФ). КФ – возникают как генетически детерминированные вещества для регуляции процессов, АФ – образуются при экстремальных условиях на определенных этапах онтогенеза.

МЕХАНИЗМ ФЕРМЕНТАТИВНОГО  КАТАЛИЗА.

Для протекания реакции необходимы 2 условия:

а) реагирующие молекулы должны войти  в контакт друг с другом; б) должны быть активированными.

Дополнительное количество Е (энергии), необходимое при данной температуре  для перевода всех молекул одного моля вещества в активированное состояние, называется энергией активации (ЭА) и обозначается  …..

Ферменты повышают скорость реакций  благодаря тому, что они снижают  ЭА.

Снижение ЭА достигается благодаря  образованию активированного фермент-субстратного комплекса (ФSК).

Различают три стадии ферментативного катализа:

Узнавание Ф. и S и образование активированного ФSК;

Каталитическое превращение веществ;

Определение Ф и продуктов реакции.

Ф. соединяются  с S при помощи АЦ (активного центра). Связывание фермента с S многоточечное при помощи слабых связей (водородных, ван-дер-ваальсовых, ион-дипольных), а ковалентные связи не образуются. Процесс этот легко обратимый. Молекулы Ф. значительно больше молекул S. Поэтому Ф. обволакивает молекулу S и при помощи слабых связей расшатывает ее. Образуется активированный ФSК. Это так называемый «эффект перчатки». Для образования ФSК необходимо соответствие конфигурации АЦ и S (как ключ к замку). Но кроме стерического соответствия должно быть и топохимическое (соответствие узнающих групп Ф. и S). Соединяясь с S, Ф. направляет биохимическую реакцию обходными путями с наименьшей затратой энергии.

В любом случае Ф. выходит из реакции  в первоначальном виде.

ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ СРЕДЫ  НА АКТИВНОСТЬ Ф.

Ф. – белки, и их активность сильно изменяется в зависимости от факторов среды.

Кинетика ферментативных реакций.

6.1. Кинетика ферментативных реакций. Кинетика – это учение о скорости реакций, их зависимости от различных факторов. Скорость фермантативной реакции определяется количеством веществ прореагировавших за единицу времени при заданных условиях. Скорость ф. реакции зависит от активности Ф., которая может быть выражена в различных единицах.

Согласно  последнему международному соглашению 1 единица любого фермента есть такое количество Ф., которое в определенных условиях катализирует превращение субстрата со скоростью 1 моль/сек. Это единица называется катал (сокращенно кат.). Это очень высокая скорость, потому обычно активность иногда выражают нано (10^-9) и пико (10^-12) каталах.

Есть и  другие единицы активности. Например, молекулярная активность или число оборотов: это число молей субстрата, которое подвергается превращению 1 молем фермента за 1 мин.

6.2. Влияние температуры. См. лабораторную работу 37 (Влияние температуры на гидролиз крахмала амилазой). Зависимость скорости биологических процессов от различных факторов описывается тремя кардинальными точками значений фактора. Минимальная точка – значение, при котором процесс идет, а ниже его – прекращается; оптимальная точка – процесс идет наиболее активно; максимальная точка – выше этого значения процесс прекращается. Температурный коэффициент ….. показывает во сколько раз возрастает скорость химической реакции при повышении температуры на каждые 10 °. Для ферментативных реакций …..= 1,4-2,0 в пределе температуры от 0° до 50°.

Минимальная (t _min)  для Ф. + 0; t _opt = 40-45° для Ф. человека и животных и 45-55° для Ф. растений; t_max + 80°.

Снижение  активности Ф. под действием высоких  температур связано с начинающейся денатурацией белка.

6.3. Влияние реакции среды (рН). В клетке присутствуют сотни различных Ф. и каждый из них активен в определенном интервале значений рН, известный под названием оптимума рН. Например, для фермента пепсина (белок, расщепляющий Ф. желудочного сока рН 1,5-2,0), амилаза солода – 4,0-5,0, уреаза (разлагает мочевину) – 7,3-7,9. Однако для большинства Ф. оптимум рН лежит в слабокислой и нейтральной среде.

6.4. Влияние концентрации (С) субстрата (S)  фермента (Ф). Константа Михаэллиса (К_m). Для описания зависимости начальной скорости реакции от концентрации S выведено уравнение для односубстратной реакции:

 

V =	Vmax [S]
	Кm + [S]

Где V – скорость реакции;

       V_max – максимальная скорость;

                   К_m –  константа Михаэллиса;

           [S] – концентрация субстрата.

К_m характеризует средство Ф. к S. К_m равна концентрации S. К_m равна концентрации S, при которой скорость ферментативной реакции составляет половину от максимальной.

Скорость ферментативной реакции  зависит от количества Ф. в среде. Когда S в среде достаточно, то скорость реакции возрастает пропорционально увеличению количества Ф.

6.5. Активаторы и ингибиторы Ф. Активаторы (А) – вещества, ускоряющие скорость ферментативных реакций. К ним относят:

1) ионы макро- и микроэлементов: K⁺; Ca²⁺; Mg²⁺; Fe²⁺; Cu²⁺; Co²⁺; Mn²⁺ и др. Для активации фермента необходим один или несколько ионов. Причина активации ионами Ф. в том, что они входят или в состав Ф. (например, микроэлементы), или выполняют роль кофакторов, способствующих образованию координационных связей между активным центром Ф. и S.

2) Другие вещества. Например, активность  амилазы (расщепляет крахмал)  повышается в присутствии ионов  хлора, брома, йода. Особенно сильно активируют амилазу ионы хлора при рН 6,5-7,0. Поэтому содержание крахмала в растениях снижается при известковании и под влиянием хлора.

Протеазы – белок расщепляющие Ф. активируются при наличии в  среде HCN, H₂S и веществ, содержащих сульфгидрильные группы – SН.

Ингибиторы Ф. – вещества, подавляющие  действие Ф. х изучение дало значительно  больший практический интерес, чем  изучение активаторов.

Ингибиторы (Н)подразделяются на общие  и специфические. Общие подавляют  действие всех Ф. К ним относятся:

1) ионы тяжелых металлов (Pb²⁺; Cd²⁺; Hg²⁺; Cu²⁺; Zn²⁺ и др.). К тяжелым металлам относятся как очень вредные элементы (свинец, кадмий, мышьяк, ртуть и др.), так и необходимые растению в небольших количествах микроэлементы (медь, цинк, железо, кобальт, марганец и др.). Поэтому надо применять микроэлементы в рекомендуемых дозах и избегать накопления их избытка в почве.

2) трихлоруксусная кислота, танин  и др. Общие ингибиторы вызывают  денатурацию белка и этим самым  подавляют действие всех Ф.

Специфические ингибиторы подразделяются на конкурентные и неконкурентные. Конкурентное ингибирование обратимо. Оно происходит когда ингибитор по своей конфигурации близок к специфическому субстрату данного Ф. Так как Ф. подходит к S как ключ к замку, то ингибитор, имеющий сходную структуру с S, соединяется с активным центром Ф., инактивирует ингибитор и S за Ф. Если удалить из реагирующей смеси ингибитор, то реакция между Ф. и S возобновляется.

Значение конкурентного ингибирования:

Можно с помощью их установить структуру активного центра Ф.К;

Механизм действия многих лекарственных  препаратов основан на конкурентном ингибировании. Например, белый стрептоцид.

Неконкурентное ингибирование  необратимо. В данном случае И. имеет  не близкую структуру, а соединяется при помощи химических связей и определенных группировок с активным центром Ф., вызывая его инактивацию. К ним относятся: ионы синильной кислоты (СN^-), CO (угарный газ), ртуть (Hg²⁺) и др.

Важнейшими неконкурентными ингибиторами являются фосфорорганические соединения. Фосфорорганические ингибиторы – сильные яды и их используют в качестве инсектицидов (например, хлорофос, дихлофос и др.)