Министерство
аграрной политики Украины
Днепропетровский
государственный аграрный университет
Институт биотехнологии
и здоровья сельськохозяйственных
животных
Кафедра фізіології
та біохімії сільськогосподарських тварин
РЕФЕРАТ
на тему:
«Альтернативные
методы исследования в ветеринарной медицине»
Выполнила: Янович Г.В.
Маг. – 2 –10
Проверила:
д.в.н., профессор Степченко
Л.М.
г. Днепропетровск
2010р.
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………………………………….
3
- Диагностика коронавирусной инфекции методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)…………………………………………………………………………………......4
- Термографический метод в ветеринарной онкологии…………………………….6
- Использование ионизирующих излучений для диагностики болезней и лечения животных………………………………………………………………….....12
- Специальные методы исследования крови………………………………………..13
- Флуоресцентный иммуноанализ с временным разрешением…………………...14
- Определение токсинов и остаточных количеств чужеродных веществ…….....21
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………………………..22
ВВЕДЕНИЕ
Прогресс в науке всегда
был связан с непрерывным приумножением
знаний, которые позволили создавать новые
теории. Следует отметить ее интенсивное
развитие: в 1960-1970-е годы возникло даже
понятие «информационный взрыв»; начали
говорить о перепроизводстве информации.
Объем знаний рос в геометрической прогрессии,
он удваивался каждые 10-15 лет. Считалось,
что в не далеком будущем наступит информационное
насыщение, когда ученые уже будут не состоятельны,
воспринимать и прорабатывать новые знания.
На сегодня поток информации продолжает
нарастать, о чем свидетельствуют постоянные
публикации в журналах и других научных
изданиях. Но публикации - это только видимая
часть информации и не всегда наиболее
ценная. А относительно содержания качественно
новых данных и выводов, то скорее чувствуется
их недостаток, чем излишек. Высокие темпы
поступления научной информации в эпоху
научно-технической революции сопровождаются
ее ускоренным старением. Иногда такая
информация «погибает», не дав ни новых
идей, ни практической или научной отдачи.
Современный этап научно-технической
революции нуждается в переоценке многих
устарелых концепций. Подсчитано, что
информация обесценивается за 4-8 лет. А
поэтому следует мобильно вносить изменения
в научную и техническую политику.
- Диагностика коронавирусной инфекции методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)
Коронавирусные инфекции
кошек и собак вызываются представителями
рода Coronavirus (семейство Coronaviridae). Основным
проявлением коронавирусной инфекции
у собак является диарея. У кошек коронавирусы
вызывают энтериты и инфекционный перитонит,
широко распространенные среди диких
и домашних кошек. Возбудителем коронавирусной
инфекции у собак является Canine coronavirus,
вызывающий острый коронавирусный энтерит.
Заболевание передается при непосредственном
контакте с носителем вируса (через слюну
и фекалии). Данной инфекции подвержены
собаки любого возраста, однако чаще всего
поражаются щенки и ослабленные животные,
которые уже перенесли другую болезнь,
например парвовирусную инфекцию. Основные
симптомы заболевания — рвота и диарея,
иногда с примесью крови, обезвоживание
организма, потеря в весе, апатия. Через
3-4 недели после выздоровления может развиться
повторное заболевание. При проведении
диагностики коронавирусный энтерит собак
необходимо дифференцировать от парвовирусного
энтерита, аденовирусной инфекции кишечного
типа и чумы плотоядных. Коронавирусы,
поражающие кошек, представлены двумя
биотипами: FECV, или коронавирус энтерита
кошек, и FIPV — вирус инфекционного перитонита
кошек (2, 3). Носителями FECV является 16-50%
домашних кошек, у которых вирус локализуется
в тонком кишечнике, не вызывая заболевания
или становясь причиной легкой диареи.
В то же время у 5-12% носителей может наблюдаться
мутация условно-патогенной кишечной
формы FECV в патогенную (FIPV), что приводит
к развитию болезни (2). Инфекционный перитонит
(ИП, FIP) кошек, заканчивающийся, как правило,
летально, протекает в двух формах — влажной
и сухой. Влажная (экссудативная) форма
ИП характеризуется поражением кровеносных
сосудов брюшной или грудной полостей,
сопровождающимся выпотеванием плазмы
в указанные полости (рис. 1). У больных
животных, развивается асцит (рис. 2), а
в случае скопления жидкости — нарушение
функции дыхания. На серозных покровах
органов брюшной полости формируются
фибринозные наложения (рис. 3), в дальнейшем
могут образовываться спайки. Вследствие
нарушения функции печени наблюдается
эктеричность склер и кожных покровов.
Сухая (неэкссудативная) форма ИП протекает
без скопления жидкости в брюшной и грудной
полостях. В этом случае страдают внутренние
органы — головной мозг (рис. 4), печень,
почки, поджелудочная железа, в 25% случаев
наблюдаются поражения глаз (рис. 5) (5).
Поскольку эффективная схема лечения
ИП пока не разработана, первостепенное
значение имеют профилактические меры,
направленные на раннее выявление вирусоносительства
(1, 3). Диагностика инфекционного перитонита
кошек также проблему. Традиционные методы
выявления возбудителя, основанные на
обнаружении антител к коронавирусам
(РНГАи ИФА), дают до 60% ложноположительных
результатов. Это обусловлено присутствием
в кишечнике кошек условно-патогенных
штаммов возбудителя (2, 3). В ряде зарубежных
лабораторий применяется комплексная
методика диагностики ИП, включающая определение:
— титра антител
к коронавирусу;
— соотношения
альбуминов/глобулинов в транссудате
или плазме крови;
— уровня а-1 кислого
гликопро-теина (AGP);
— цитологических
и гематологических показателей (4).представляет
серьезную Материалы и методы.
В исследовании был использован
штамм коронавируса «Багира» (5 1оg ТЦД50/мл)
в разведениях, 8 изолятов коронавирусов
кошек (FCoV), 2 изолята коронавируса собак
(CCV) и суспензии вируса панлейкопении
кошек и калицивируса кошек. При
испытании ПЦР-тест-системы использовался
биологический материал здоровых кошек,
животных с клиническими признаками
ИП и кошек с неспецифическими
симптомами. Среди исследованных
животных были как содержащиеся в
питомниках, так и находящиеся
на индивидуальном содержании. Биологический
материал параллельно исследовался
методами ПЦР и РИГА. С помощью
ПЦР-системы исследовались фекалии,
плазма крови, транссудат при специфическом
асците, а методом РИГА — сыворотка
крови и транссудат. Серологические
тесты проводились с использованием
набора для выявления антител
к коронавирусам плотоядных в
РИГА (ТУ 9388-025-00494189-01). Биологический
материал собак исследовался методом
ПЦР. Однако данное исследование требует
значительных затрат времени и средств.
В связи с этим эффективным
методом диагностики ИП может
служить полимеразная цепная реакция
(ПЦР), которая позволяет не только
выявлять коронавирусы кошек, но и проводить
дифференциацию условно-патогенных и
патогенных штаммов исходя из различной
локализации их в организме. При
этом обнаружение вируса в фекалиях
кошек свидетельствует о носительстве
условно-патогенных штаммов (FECV), а в
плазме крови или асцитной жидкости
— о циркуляции в организме
животного патогенных штаммов (FIPV) и,
следовательно, о заболевании. Цель
настоящего исследования — испытание
тест-системы для диагностики
коронавирусной инфекции у кошек
и собак на основе ПЦР. Выделение
РНК проводилось с использованием
набора «РНК-сорб» (ЦНИИЭ), в основе
которого лежит метод ее сорбции
на силикагеле. ПЦР проводилась на
амплификаторе ТЕРЦИК («ДНК-технология»)
по стандартной методике. Полученные
ПЦР-продукты визуализировались методом
электрофореза в 1,5% агарозном геле,
содержащем бромистый этидий. В процессе
исследования проведен анализ сведений
о нуклеотидных последовательностях представителей
семейства Coronaviridae, в частности различных
изолятов коронавирусов кошек и собак,
опубликованных в базах данных Entrez, GeneBank,
EMBL и DDBJ. Кроме того, изучена литература,
характеризующая структуру геномов FCoV,
CCV и их генетическое родство с другими
представителями семейства. В качестве
мишеней для специфических праймеров
были выбраны две консервативные последовательности
в гене нуклеокапсидного протеина. Специфичность
предложенных праймеров изучалась с помощью
компьютерных программ FASTA и BLASTA. В результате
проведенной работы была выявлена гомология
выбранных олигонуклеотидов только с
генами нуклеокапсидного протеина FCoV
и CCV и не обнаружено их значимой гомологии
с нуклеотидными последовательностями
иных видов семейства Coronaviridae, а также
каких-либо других вирусов, бактерий или
эукариот. Таким образом, предложенные
праймеры, исходя из теоретических расчетов,
должны обладать 100% специфичностью. На
следующем этапе исследования были оптимизированы
условия выделения РНК вируса и проведения
реакции обратной транскрипции и ПЦР,
а также определены специфичность и чувствительность
ПЦР-анализа. Размер ПЦР-продукта составил
350 пар нуклеотидов. Метод показал 100% специфичность
и высокую чувствительность. Обнаружение
коронавируса в фекалиях кошек свидетельствовало
о носительстве его условно-патогенных
штаммов в кишечнике, обнаружение FECV в
транссудате и плазме крови — о развитии
заболевания. При исследовании методом
РНГА положительным результатом считалось
обнаружение у животного титра антител
> 1:128. Однако это могло указывать как
на вирусоносительство, так и на манифестированную
форму инфекции. Кроме того, положительный
титр мог быть обусловлен наличием контакта
с коронавирусом ранее. В качестве материала
от собак исследовались фекалии, и обнаружение
в них РНК коронавируса свидетельствовало
о заболевании, вызванном CCV. В ходе эксперимента
был исследован биологический материал,
взятый у 193 кошек (таблица). Методом РНГА
положительный результат был зафиксирован
у 131 животного (титры антител > 1:128). При
тестировании «сероположительных» кошек
методом ПЦР РНК коронавируса была обнаружена
в плазме и асцитной жидкости у 12 животных
(9%), только в фекалиях - у 68 (52%) и у 51 (39%)
- не обнаружена вовсе. Таким образом, 52%
кошек с серопозитивным результатом являлись
носителями условно-патогенных штаммов
коронавируса, а 39% были здоровы. Очевидно,
что исследование методом РНГА дало 63%
ложноположительньгх результатов (в пересчете
на общее количество исследованных животных).
Полученные результаты свидетельствуют
о том, что диагностика коронавирусной
инфекции кошек традиционным серологическим
методом (РНГА) дает более 60% ложноположительных результатов, поскольку не позволяет
дифференцировать состояние носительства
от истинного заболевания. Кроме того,
"сероположительными» считались животные,
имевшие контакт с коронавирусом ранее.
Использование метода ПЦР позволило провести
дифференциацию условно-патогенных и
патогенных штаммов в связи с их раз личной
локализацией в организме и отличить состояние
носительства от заболевания. Таким образом,
данные проведенного исследования говорят
о целесообразности использования метода
ПЦР для выявления коронавирусов кошек
и собак и постановки окончательного диагноза.
В соответствии с приказом № 45 Департамента
ветеринарии МСХ РФ в период с 03.08.2004 г.
по 06.08.2004 г. были проведены комиссионные
испытания тест-системы для диагностики
инфекционного перитонита кошек методом
ПЦР. Тест-система успешно прошла комиссионную
апробацию, показав 100% специфичность и
высокую чувствительность в рамках предложенной
панели. В настоящее время тест-система
«Коронавир» для выявления и идентификации
коронавирусов кошек и собак, основанная
на ПЦР, успешно используется в ветеринарной
практике (ТУ 9388-142-00494189-05; РУ № Р077-1-3.5-0813
зарегистрирована в РФ за № ПВР-1-3.5/01556
от 30.06.06 г. сроком на 5 лет).
- Термографический метод в ветеринарной онкологии
Термография — метод функциональной
диагностики, в основе которого лежит
регистрирование ИК-излучения тела.
Информация о распределении температуры
на поверхности тела визуализируется
на экране тепловизора в виде цветовой
сканограммы. Различные цвета соответствуют
различным температурам (рис. 1).
В медицине информативность
ИК-термографии в подтверждена
при диагностике различных новообразований
— меланомы кожи, рака языка,
гортани, плоскоклеточного рака
и базалиомы ушной раковины и
сосцевидного отростка [9].
У здоровых животных, как
и у человека, в распределении
температуры отмечена симметрия
относительно средней линии тела
(рис. 2). Нарушение термосимметрии указывает
на патологию. Существует так называемая
физиологическая термоасимметрия,
которая отличается от патологической
меньшим перепадом значений температуры
для каждой отдельной части тела,
например, в норме у человека для
груди, живота и спины перепад
температуры не превышает 1,0 °С. В
ветеринарии имеется ряд работ
по использованию термографии для
диагностики воспалительных заболеваний
суставов и мягких тканей у лошадей [11,
13]. Работы по применению термографии для
диагностики и контроля лечения новообразований
у животных практически отсутствуют. Известно,
что границы термографического изображения
злокачественной опухоли, как правило,
превышают ее визуально определяемые
границы, что обусловило введение такого
термина, как «опухолевое поле» — зона
между периметрами термографического
и визуального изображения опухоли [9].
При ориентации на опухолевое поле можно
более адекватно планировать объем хирургического
вмешательства. ИК-термография также будет
полезна для мониторинга в послеоперационном
периоде, контроля заживления и раннего
выявления гнойно-воспалительных процессов.
Кроме того, с помощью данного метода можно
контролировать температуру в области
локализации опухоли при гипертермическом
воздействии.
Цель данного исследования
состояла в оценке информативности
термографии как метода диагностики
в ветеринарной онкологии. Была проанализирована
возможность термографического
контроля процессов заживления после
хирургического удаления опухоли и
локальности нагрева при лазерной
гипертермии новообразований.
Прежде чем приступать
к тепловизионному исследованию,
животное необходимо адаптировать к
температуре окружающей среды. Для
человека оптимальным временем адаптации
считают 20 мин [11]. У животных это может
занять более 30 мин из-за шерстного покрова.
Помещение для термографического исследования
должно быть закрытым, с постоянной температурой
20...22 °С. Всего исследовано 173 больных животных
(77 собак, 96 кошек) в возрасте от 8 до 14 лет
с диагнозом новообразования различного
генеза и 26 здоровых того же возрастного
диапазона (10 собак и 16 кошек). Все термограммы
представлены в диапазоне температур
от 25 до 41 °С, кроме термограмм при лазерном
воздействии, где диапазон 25...70 °С. Для
бесконтактного измерения и регистрации
температуры использовали инфракрасный
тепловизор IRISYS 4010 фирмы InfraRed Integrated System
Ltd (Великобритания) с неохлаждаемой болометрической
матрицей, что делает его более удобным
в применении, чем тепловизор, охлаждаемый
жидким азотом. Чувствительность указанной
модели составляет 0,15 °С. Диапазон регистрируемых
температур от -10 до 250 "С. При термографических
исследованиях в ветеринарии особое значение
приобретает быстрота сканирования, т.к.
до-биться длительной неподвижности животного
без применения общей анестезии сложно.
Скорость сканирования данной модели
8 кадров в секунду, что вполне достаточно.
Карта памяти тепловизора позволяет регистрировать
до 6000 термограмм размером 120 х 160 пикселей.
Диапазон расстояний отчетливой фокусировки
от 30 см до бесконечности. Минимальный
размер объекта, температуру которого
можно измерить, зависит от дистанции
между тепловизором и объектом. Наибольшее
разрешение (минимальное расстояние между
соседними точками исследуемого объекта,
которые на термограмме соответствуют
двум соседним пикселям) достигается при
размещении прибора в 30 см от исследуемого
объекта и составляет 0,5 мм. Файлы зарегистрированных
термограмм с помощью картридера легко
переносятся в компьютер для дальнейшей
обработки. Получаемые термограммы анализируются
при помощи программного пакета Imager IRISYS
4000. Для объективного контроля температуры
при лазерном воздействии на опухоли необходимо,
чтобы на результаты тепловизионных измерений
не влияло рассеянное лазерное излучение,
что вполне достижимо, т.к. диапазон длин
волн, воспринимаемых тепловизором IRISYS
4010, составляет 8...14 мкм, а длина волны используемого
в данной работе полупроводникового лазера
0,81 мкм. Термографический контроль в предоперационном
периоде. Поскольку у животных густой
шерстный покров, бо-лее высокая температура
па термограммах не обязательно соответствует
участкам тела с более высокой температурой,
а может быть на участках, где покров менее
густой (надбровные дуги, область живота
и т.п.). Тепловизор регистрирует температуру
поверхности тела, которая обычно ниже
температуры, измеряемой ректально. Наиболее
высокие значения температуры на термограмме,
совпадающие с ректальной температурой,
в норме наблюдают в области глаз, в подмышечных
впадинах, по средней линии живота при
от-сутствии шерстного покрова. Самым
холодным участком является нос. Температура
носа в спокойном состоянии примерно на
10 °С ниже температуры глаз. На рисунке
2а температурный профиль показывает,
что минимальная температура носа у кота
25,8 °С, а температура глаз 38,3 °С. Температура
носа у собак сильно повышается при эмоциональном
возбуждении. Термограммы, представленные
на рисунке 2, иллюстрируют симметричное
распределение температуры тела у здоровых
животных. Диаграммы отражают распределение
температуры вдоль вертикального и горизонтального
сечепий, показанных на рисунке зелеными
линиями. Диагностическое значение имеют
не столько абсолютные значения температуры,
сколько температурная асимметрия тела
и температурные различия соседних участков
— здоровых и с патологией.
Температурная асимметрия области
морды и живота у здоровых животных
не превышает 1 °С. Область молочных
желез у собак имеет температуру
примерно на 0,5 °С выше температуры
окружающих участков кожи, однако соски
в норме холоднее на 4...6 "С. Данный
факт можно использовать для ранней
диагностики патологических процессов,
до их клинического проявления. Например,
при исследовании клинически здоровых
собак у двух животных было обнаружено
повышение температуры сосков до
температуры окружающей кожи, впоследствии
у них была выявлена мастопатия.
Далее представлены термограммы
различных опухолевых процессов, как
доброкачественных, так и злокачественных.
Все диагнозы подтверждены гистологически.
Для сравнения рядом с термограммами
приведены фотографии тех же объектов
в видимом свете. На термограмме
рис. За видно, что новообразование
холоднее окружающих тканей, что говорит
о слабой васкуляризации и отсутствии
воспалительного процесса. Фотография
данного новообразования приведена на
рисунке 3б. На рисунках 4 и 5 показаны термограммы
доброкачественных новообразований с
хроническим воспалительным процессом.
Температура в области новообразования
идентична или ниже температуры окружающих
тканей. Размер и форма новообразования
па фотографии и термограмме совпадают.
Область новообразований па термограммах
обведена белой линией.
Термография слизистой ротовой
полости осложняется повышенной
температурой нормальных тканей и сильной
вариабельностью температуры, обусловленной
влажностью слизистых оболочек. При
этом температура существенно меняется
в зависимости от частоты дыхания
за счет того, что изменяется интенсивность
процесса испарения. Температура патологической
ткани в данном случае на 3 °С выше
температуры нормальной ткани. Термографический
контроль в послеоперационном периоде.
Непосредственно после хирургического
вмешатель-ства у 11 животных в области
послеоперационной раны вследствие нарушения
микроциркуляции местная темпера-тура
была понижена в среднем на 3 °С. С 3-х по
5-е сут. у большинства животных в этой
области отмечено незначительное повышение
местной температуры, в среднем на 1 °С,
что свидетельствует о пормэргическом
течении воспаления, в то время как у двух
животных в области формирующегося рубца
местная температура повышалась в среднем
па 2,5 °С. При термографическом исследовании
у них отметили отторжение внутренних
швов и образование свищевых каналов,
границы которых четко определялись.
Термографический контроль
в процессе гипертермии опухоли.
Хирургический способ лечения злокачественных
новообразований кожи наружного
слухового прохода и слизистых
оболочек полости рта и носа относится
к высокотравматичным. В ряде случаев
его невозможно применить из-за труднодоступности
и большого риска травмирования
жизненно важных органов. В связи
с этим особый интерес вызывают альтернативные
методы, IT В частности лазерная гипертермия.
Под общей анестезией опухоль (в
области наружного слухового
прохода у кота) была обработана
лазерным излучением. Использовали полупроводниковый
лазер PhotoThera с длиной волны 0,81 мкм. Воздействовали
при непрерывном режиме работы лазера
при выходной мощности 2 Вт. Предположительно,
основная доля энергии лазерного
излучения поглощалась содержащимися
в опухоли пигментами, что приводило
к резкому локальному повышению
температуры. Приведена термограмма
при лазерном воздействии на новообразование
фотография этой опухоли до воздействия.
Диаграмма иллюстрирует распределение
температуры вдоль горизонтального сечения,
показанного на рисунке горизонтальной
зеленой линией. Температура в области
облучения в среднем на 20 "С выше температуры
окружающих тканей. Непосредственно в
центре гауссова пучка излучения мазера
температура поверхности биоткани может
превышать 70°С [9]. В комплексе с другими
методами исследования термография помогает
определить наличие воспалительного процесса
в злокачественных и доброкачественных
опухолях, уточнить размеры и локализацию
опухолей, а также может быть полезна в
послеоперационном мониторинге процессов
заживления. Термография — безвредный
и неинвазивный метод, что позволяет применять
ее многократно, наблюдать процессы в
динамике, а также использовать для раннего
выявления патологических процессов различной
этиологии. Интерпретация термограмм
в настоящее время представляет довольно
сложную задач), и создание атласа термограмм
отдельных органов мелких животных значительно
бы облегчило ее решение [10].