Диагностика чумы крупного рогатого скота

1.ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

 

1.1.Диагноз на чуму крупного  рогатого скота (чуму КРС) ста-

вят на основании эпизоотологических данных, клинических признаков

болезни, патологоанатомических изменений и лабораторных исследова-

ний патматериала от павших и больных животных.

 

1.2. Лабораторная диагностика чумы  КРС основана на примене-

нии комплекса серологических,вирусологичесских, физико-химических

методов исследования и постановке биопробы (см.схема I) и включа-

ет:

- исследование проб патматериала  на наличие специфического

антигена вируса чумы КРС в реакциях связывания комплемента (РСК),

диффузионной преципитации в агаровом геле (РДП), непрямой гемаг-

глютинации (РНГА) и реакции нейтрализации (РН), методами иммуно-

ферментного анализа (ИФА) и флуоресцирующих антител (MФА);

- исследование проб сывороток  крови от перебо-

левших животных на наличие специaических антител в РСК, РДП, ИФА и РН;

 

- выделение возбудителя болезни  в первичной

культуре клеток почки телят (ПТ) или перевиваемых

культурах клеток почки овцы (ПО) и почки свиньи (СПЭВ)

с последующей идентификацией выделенного вируса в РН,

ИФА, МФА, РСК, РНГА;

- исследование проб патматериала  и зараженной

культуры клеток на наличие вируса чумы КРС методами

электронной (ЭМ) и иммуноэлектронной (ИЭМ) микроскопии;

- постановку биопробы на восприимчивых животных,

неиммунных и иммунных к вирусу чумы КРС, с последующим

подтверждением специфичности заболевания в серологичес-

ких реакциях.

 

1.3. По результатам серологических  исследований

диагноз на чуму КРС ставят на основании обнаружения

вирусного антигена в органах и тканях павших и убитых больных животных

в РСК, РПД, ИФА, РНГА, МФА (не менее, чем в двух из указанных реакций) и спе-

цифических антител у переболевших животных в РСК, РДП и РН.

 

При получении сомнительных результатов сероло-

гических исследований проводят выделение возбудителя

болезни в чувствительных культурах клеток и постановку

биопробы на крупном рогатом скоте. В этом случае диагноз на чуму КРС

ставят на основании выделения и идентификации возбудителя болезни в РН,

ИФА, МФА и подтверждения специфичности заболевания животных в

серологических реакциях.

 

1.4. Для постановки диагноза по  результатам серологических

исследований требуется 24-72 ч, а по результатам выделения,

идентификации возбудителя болезни и постановки биопробы с под-

тверждением специфичности заболевания необходимо 15-30 суток.

 

1.5. Чуму КРС необходимо дифференцировать  от злокачественной

катаральной горячки, ящура, вирусной диареи, инфекционного рино-

трахеита, геморрагической септицемии и кровепаразитарных болезней.

 

2. ВЗЯТИЕ И ПОДГОТОВКА ПАТОЛОГИЧЕСКОГО  МАТЕРИАЛА

ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ

 

2.1. В лабораторию для  исследования  направляют пробы органов

и тканей от  убитых больных и павших животных, гепари-

низированную кровь от больных и сыворотку крови от переболевших

животных.

 

2.2. Пробы патологического материала  берут от 3-5

павших и 1-2 голов  убитых больных животных, убой кото-

рых проводят в период максимального проявления, клинических призна-

ков болезни, характерных для  чумы КРС (на 3-4 сут гипертермии).

Патматериал от трупов берут не позднее 4-6 ч после гибели

животных.

 

От павших и убитых животных берут предлопаточные,

заглоточные и мезентериальные лимфатические узлы, кусочки селезен-

ки и пораженные участки слизистых оболочек сычуга и кишечника.

Масса проб каждого органа должна быть не менее 10 г.

 

Каждую пробу патматериала берут отдельно в стерильную плотно

закрывающуюся посуду (флаконы) или полиэтиленовые пакеты, которые

упаковывают в общий полиэтиленовый пакет с ватой, смоченной 1-2%

раствором хлорамина, и помещают в термос со льдом.

 

2.3. Кровь для вирусологических  исследований берут от 5-10

больных животных через 2-3 сут   после подъема температуры тела

в объеме 10-15 см3 в стерильные пробирки или пенициллиновые фла-

коны с резиновыми пробками, содержащие гепарин (5 ЕД на I см3

крови). Взятую кровь тщательно перемешивают с гепарином, упаковы-

вают в общий полиэтиленовый пакет и помещают в термос со льдом.

 

2.4. Кровь для серологических  исследований берут от 10-15 пе-

реболевших животных в стерильные пробирки в объеме 10-15 см3

не ранее 2 недель после переболевания. Одновременно берут кровь от

10 неболевпшх  животных этой  же фермы. Пробирки с кровью  поме-

щают на 3-4 ч, в тепло (тепература 30 - 37°С), а затем на

16-18 ч; при (4(1)°C. Сыворзтку осторожно отбирают и переносят

в стерильные пробирки или пенициллиновые флаконы с резиновыми

пробками, упаковывают в общий полиэтиленовый пакет и помещают

в термос со льдом.

 

2.5. При взятии патологического  материала каждую пробу нуме-

руют. В сопроводительном документе на патматериал указывают: по-

рядковый номер, наименование, дату взятия и краткую характеристику

каждой пробы. К сопроводительному документу прилагают краткую

пояснительную записку, в которой указывают: наименование хозяйства,

фермы, время и место появления, заболевания, количество заболевших

и павших животных, клинические признаки и картину патвскрытия,

краткие эпизоотологические данные.

 

2.6. Отобранный патологический материал  направляют в лабора-

торию с нарочным в опечатанном  термосе со льдом или  термочемодане при стро-

гом соблюдении ветеринарно-санитарных мер предосторожности.

 

2.7. Поступивший патологический  материал освобождают от

соединительной ткани, взвешивают по 3-5 г каждого органа, измель-

чают ножницами и тщательно растирают в фарфоровой ступке со стериль-

ным песком или битым стеклом. Гомогенат разводят стерильным 0,85%

раствором хлорида натрия, до 20% концентрации, замораживают, отта-

ивают и центрифугируют при 3 тыс. об/мин, в течение 30 мин.

Надосадочную жидкость используют для выявления антигена в сероло-

гических реакциях в концентрации, указанной в соответствующих

методиках.

 

2.8. Гепаринизированную кровь, поступившую  для выделения

вируса, используют для заражения культур клеток в цельном виде и

в  разведении 1:10. При поступлении свежевзятой гепаринизирован-

ной крови без признаков гемолиза для выделения, вируса лучше ис-

пользовать лейкоцитарную фракцию крови. С этой целью кровь цент-

рифугируют при 2,5-3 тыс.об/мин  в течение 20 мин и образовав-

шийся слой клеток (лейкоцитарная фракция) на границе плазмы и эритроцитов

используют для  заражения  клеточных культур.

 

 

             Общая схема проведения лабораторных исследований                   

патологического материала на чуму КРС

Схема 1

 

2.9. Пробы сывороток крови исследуют  в РСК и РДП без прогре-

вания, в РН - только после предварительной инактивации  при

(56±1)°С в течение 30 мин.

 

3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ПРОБ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО  МАТЕРИАЛА

 

3.1. Реакция связывания комплемента

 

3.1.1. Реакция связывания комплемента (РСК) применяется

для прижизненной и посмертной диагностики чумы крупного рогатого

скота путем обнаружения антигена в патологическом материале,

выявления антител в сыворотках крови переболевших животных и иден-

тификации возбудителя, в инфицированной клеточной культуре.

 

3.1.2. Компоненты реакции:

- гемолизин - биофабричного производства;

- комплемент - биофабричного производства  с активностью

               не ниже 1:40;

- 2,5% взвесь эритроцитов барана на физиологическом растворе;

- стандартные (специфическая и  нормальная) сыворотки;

- стандартные (специфический и  нормальный) антигены;

- испытуемые антигены или сыворотки;

- 0,85% раствор хлорида натрия (физиологический  раствор).

 

3.1.3. РСК при чуме крупного  рогатого скота ставят в объеме

0,5 см3. Реакцию проводят при двух  температурных режимах: (4±2)°С

в течение 16-18 ч. (фаза связывания комплемента) и (37±1)°С

в течение 45 мин. (фаза выявления). Разведения  компонентов реакции

готовят на физиологическом растворе. Все сыворотки (испытуемые,

заведомо специфические и нормальные) в РСК используют без пред-

варительного прогревания. Перед постановкой главного опыта прово-

дят титрование гемолизина согласно наставлению по его применению.

Гемолизин применяют в составе гемсистемы, которую готовят путем

смешивания равных объемов гемолизина в рабочем титре и 2,5% взвеси

эритроцитов барана. Приготовленную смесь выдерживают в термостате

при (37(1)°C в течение 45 мин и используют в РСК в дозе 0,2 см3.

 

3.1.4. Постановка качественной РСК

Для  обнаружения специфического антигена в испытуемых пробах

РСК ставят одновременно с двумя  стандартными (специфической и

нормальной) сыворотками, взятыми в рабочем титре, указанном на

этикетках. Испытуемые органо-тканевые антигены используют в раз-

ведении 1:20, культуральные - 1:4.

 

Для выявления специфических антител в истуемых сыворотках

РСК ставят одновременно с двумя стандартными (специфическим и нор-

мальным) антигенами в рабочем титре. Испытуемые сыворотки исполь-

зуют в разведении 1:10.

 

В качестве контроля служат стандартные антигены и сыворотки

в рабочем титре.

 

3.1.5. PCК  ставят с 9 дозами комплемента, которые готовят  по схеме 2.

Схема 2

Компоненты	№ пробирок
	1	2	3	4	5	6	7	8	9
Комплемент в разведении 1:5, куб. см	0,2	0,3	0,4	0,5	0,6	0,7	0,8	0,9	1,0
Физиологический раствор, куб. см	0,8	0,7	0,6	0,5	0,4	0,3	0,2	0,1	-
Общий объем смеси, куб. см	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
Доза комплемента в 0,1 куб. см  смеси	0,02	0,03	0,04	0,05	0,06	0,07	0,08	0,09	1,0

Для постановки РСК каждый испытуемый и контрольный антигены

в объеме по 0,1 см3 вносят в два ряда пробирок (по 9 пробирок в

каждом ряду). Затем в пробирки первого ряда добавляют по 0,1 см3

нормальной, а в пробирки второго - по 0,1 см3 специфической стан-

дартных сывороток в рабочем разведении. При исследовании сыворо-

ток компоненты разливают по 0,1 см3 в следующем порядке: испытуе-

мые и контрольные сыворотки - в 2 ряда пробирок, потом в первый

ряд вносят нормальный антиген, во второй - специфический.

 

Затем в первые пробирки каждого ряда вносят по 0,1 см3  комп-

лемента в дозе 0,02, во вторые пробирки каждого ряда - 0,03, в

третьи - 0,04 и т.д. (см.схему 3).

 

После добавления комплемента штативы с пробирками встряхи-

вают и оставляют при (4(1)OC на 16-18 ч. По истечении указанного

срока во все пробирки добавляют по 0,2 см3 гемолитической  смеси,

штативы встряхивают и помещают в термостат при (37(1)°С на 45 мин.

Учет результатов реакции проводят по 4-крестовой системе.

 

Реакцию считают:

- положительной - при задержке гемолиза   на 4 или 3 креста

в двух или более рядом стоящих пробирках, содержащих испытуемые

пробы (антигены или сыворотки) и специфические компоненты (сыворот-

ки, антигены), при полном гемолизе в аналогичных пробирках (пробирки,

содержащие одну и ту же дозу комплемента), содержащих испытуемые

пробы и нормальные компоненты;

 

-сомнительной - при задержке гемолиза  на 2 креста в двух

и более рядом стоящих пробирках с испытуемыми пробами и специфи-

ческими компонентами при полном гемолизе эритроцитов в аналогич-

ных пробирках в ряду испытуемых проб с нормальными компонентами;

 

-отрицательной - при задержке на 1 крест или полном гемолизе

эритроцитов в аналогичных пробирках испытуемого материала со спе-

цифическими и нормальными компонентами.

 

Постановка качественной РСК позволяет не только выявить на-

личие антигена или антител в исследуемых пробах, но и определить

оптимальную дозу комплемента, необходимую для проведения количест-

венного анализа поступивших проб. В приведенной схеме 3 оптималь-

ная доза комплемента для антигенов № I и № 2 составляет 0,06, для

антигена № 3 - 0,05 в объеме 0,1 см3.

 

3.1.6. Постановка количественной  РСК

Для проведения количественного анализа проб в РСК испытуемые

органо-тканевые антигены используют в разведении от 1:20 до 1:5120,

культуральные пробы и испытуемые сыворотки - от 1:4 до 1:256. Стан-

дартные антигены и сыворотки используют в рабочих титрах, компле-

мент и гемолизин в установленных титрах. Общий объем реакции 0,5 см3.

 

Реакцию считают положительной, если испытуемый органо-тканевой