Неспецифические методы лабораторной диагностики туберкулеза

Содержание:

 

  Введение

1. Специфические методы лабораторной диагностики туберкулеза

1. Бактериологические  методы исследования

1.1.Бактериоскопический метод

1.2. Посев  на питательные среды

1.3. Биологический  метод

2. Молекулярно-генетические  методы

3. Цитогистологические методы

4. Иммунологические  методы

4.1. Туберкулинодиагностика

4.2. Методы  определения специфических антител  к микобактериям туберкулеза (анти-МБТ)

4.3. Комплексная  иммунодиагностика туберкулеза

II.  Неспецифические методы лабораторной диагностики туберкулеза

III. Определение лекарственной чувствительности

Заключение

Использованная литература

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

 

В конце XX столетия после длительного периода относительного благополучия значительно возросла заболеваемость туберкулезом, появились остро прогрессирующие формы его, напоминающие "скоротечную чахотку". Эта тенденция наблюдается как в России, так и во многих экономически развитых странах Восточной, Западной Европы, США и свидетельствует о низкой эффективности противотуберкулезных мер. В процессе повседневной работы врачи часто теряют настороженность в отношении туберкулеза, ошибочно считают его редким заболеванием и не применяют методы диагностики, направленные на выявление туберкулеза даже у больных с наличием характерных клинических проявлений.

Диагностика туберкулеза основывается на данных клинических, гистологических, микробиологических исследований, оценке результатов туберкулиновых проб и тест-терапии. Из этих методов самым надежным является обнаружение микобактерий туберкулеза (МБТ), остальные же информативны только в комплексе. Современная микробиологическая диагностика туберкулеза состоит из нескольких основных групп анализов, направленных на:

• выявление (обнаружение) возбудителя;

• определение лекарственной устойчивости;

• типирование микобактерий туберкулеза.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Все методы лабораторной диагностики туберкулеза можно разделить на специфические (этиологические) и неспецифические.

 

1. Специфические методы лабораторной диагностики туберкулеза

 

В свою очередь специфические методы по видам исследований можно разделить на несколько групп. Бактериологические и молекулярно-генетические методы являются основным инструментом в лабораторной диагностике туберкулеза, они позволяют определять в организме больного присутствие возбудителя туберкулеза. Если бактериовыделение не удается выявить, а клинически исключить туберкулез не представляется возможным, могут быть использованы цитогистологические методы, с помощью которых можно обнаружить специфические туберкулезные изменения (элементы гранулемы).

С помощью иммунологических методов можно оценить реакцию иммунной системы на микобактериальные антигены и определить уровень специфических антимикобактериальных антител, что в комплексе с результатами других исследований является важной диагностической информацией. Например, при обследовании детей наиболее информативными являются иммунологические методы (реакция Пирке, проба Манту, определение специфических антимикобактериальных антител методом ИФА).

Специфические методы лабораторной диагностики туберкулеза делятся на 4 группы:

1. Бактериологические методы:

- бактериоскопия 

            - посев на питательные среды 

            - биологический метод 

2. Молекулярно-генетические методы 
3. Цитогистологические методы
4. Иммунологические методы:

-туберкулинодиагностика 

-методы определения специфических  антител к микобактериям туберкулеза (анти-МБТ) 

-комплексная иммунодиагностика  туберкулеза.

 

 

1. Бактериологические методы исследования

 

1.1.Бактериоскопический метод

Этот метод прост, экономичен и позволяет при положительном результате исследования мазка мокроты установить диагноз туберкулеза органов дыхания. Бактериоскопическому обследованию подлежат обратившиеся в медицинское учреждение лица:

– с явными симптомами заболевания;

– с наличием продолжительного (более 3 нед) кашля с выделением мокроты, кровохарканьем и болями в грудной клетке;

– контактировавшие с бациллярными больными туберкулезом;

– имеющие рентгенологические изменения в легких, подозрительные на туберкулез.

Выявление больных туберкулезом легких бактериоскопическим методом должно осуществляться во всех клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений общей сети: взрослых и детских поликлиниках, республиканских, краевых, областных, городских и центральных районных больницах, клиниках научно-исследовательских институтов, участковых больницах и сельских врачебных амбулаториях, психиатрических больницах, медико-санитарных частях пенитенциарных учреждений и др. Как минимум 3 мазка мокроты необходимо исследовать в лаборатории методом микроскопии по Цилю – Нельсену на кислотоустойчивые бактерии. Первую и вторую пробы мокроты берут в присутствии медицинского работника в день обращения пациента (с промежутком 1,5 – 2 ч), затем ему выделяют посуду для сбора утренней мокроты перед вторым посещением врача. Для получения положительного результата важно правильно организовать сбор мокроты, который следует проводить в отсутствии посторонних людей в отдельной, хорошо проветриваемой комнате. Пациенту необходимо объяснить, как следует откашливать мокроту из более глубоких отделов легких. В поликлинике или больнице все медицинские сестры должны быть обучены методике сбора мокроты. Больной должен откашливать мокроту в присутствии медицинской сестры. Следует попросить больного сделать несколько глубоких вдохов и покашлять в емкость, после чего проверить наличие в емкости мокроты. Если больной не может откашлять мокроту или она отсутствует, материал для исследования можно получить с помощью раздражающих ингаляций, промывания бронхов и желудка

 

 

 

 

 

1.2. Посев на питательные среды

 

Данные культуральных исследований более информативны, чем бактериоскопических методов, но получить ответ о наличии возбудителя туберкулеза можно лишь через несколько недель.

Посев мокроты на классические элективные среды (Левенштайна - Йенсена и др.) входит в перечень методов, выполняемых бактериологическими лабораториями. Рост первых колоний отмечают через 4-8 нед. Использование современных высокоселективных сред позволяет получать культуры в течение 1-2 нед, однако идентификация требует дополнительного времени. При идентификации микобактерии весьма информативен метод определения термостабильности каталазы микобактерии, так как указанным свойством обладают только М.tuberculosis и М.bovis.

Кроме мокроты материалом как для мазка, так и для посева является аспират желудочного содержимого, взятый натощак рано утром. Однако частота находок составляет 4-5%. В мокроте у этих же больных выявление микобактерии в 6-10 раз чаще.

 

1.3. Биологический метод

 

До появления молекулярно-генетических методов биологический метод считался наиболее чувствительным. Однако, в случаях, когда в исследуемом материале содержатся микобактерии, высоко устойчивые к препаратам изоникотиновой кислоты, не всегда удается получить развитие генерализованного туберкулеза, так как такие микобактерии иногда оказываются невирулентными или маловирулентными для морских свинок.

 

 

2. Молекулярно-генетические методы

 

Применение молекулярно-генетических методов для определения микобактерии в клинических образцах позволяет в короткие сроки осуществлять диагностику туберкулеза. Быстрота определения имеет особое значение в случаях идентификации штаммов микобактерии, отличающихся замедленным ростом. Молекулярно-генетические методы имеют неоспоримое превосходство над культуральными в случаях, когда в образце содержатся нежизнеспособные и/или некультивируемые микобактерии.

Применение системы ВАСТЕС с использованием ДНК-зондов позволяет в 2-4 раза, по сравнению с культуральным методом, сократить время, необходимое для выявления микобактерии туберкулеза. Но наиболее перспективным для применения в практических лабораториях оказался метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющий проводить идентификацию микобактерии туберкулеза в клинических образцах в течение 48 ч.

Метод ПЦР основан на ферментативной амплификации специфических участков генома микобактерии туберкулеза и дальнейшей детекции и идентификации полученных ампликонов. Аналитическая чувствительность метода составляет от 1 пкг до 5 фг микобактериальной ДНК в образце, что эквивалентно выявлению единичных (1-10) клеток.

В настоящее время разработаны и используются системы для амплификации следующих участков генома микобактерии туберкулеза: области последовательности IS 6110, гена, кодирующего белок теплового шока массой 65 кДа, фрагмента гена МРВ64 и гена 165 рРНК, гена белка массой 70 кДа.

Оценка различных систем амплификации показала, что чувствительность метода составляет от 80 до 97%. С помощью метода прямой амплификации рРНК микобактерии туберкулеза выявляют в 96,3% клинических и в 97,7% культуральных образцов. Совместное использование в ПЦР-анализе двух или трех систем амплификации позволяет повысить чувствительность определения до 98%. При исследовании 3 образцов от пациента чувствительность метода может достигать 100%.

Метод ПЦР позволяет проводить избирательную амплификацию фрагментов нуклеиновых кислот, строго специфичных только для бактерии mycobacterium tuberculosis, поэтому специфичность ПЦР-анализа микобактерий туберкулеза может составлять до 100%.

 

 

 

 

 

3. Цитогистологические методы

 

Главная задача цитогистологических методов в лабораторной диагностике туберкулеза - это обнаружение специфических туберкулезных изменений (элементов гранулемы). В зависимости от локализации специфического процесса по возможности производится пункция пораженного органа или ткани с последующим цитогистологическим исследованием полученного материала. Ниже приведены описания некоторых таких исследований и их результаты.

Исследование мокроты и бронхоскопического материала

У больных туберкулезом, как и хроническими воспалительными заболеваниями легких, можно встретить в мокроте комплексы эпителиальных клеток, потерявших характерную для выстилки бронха морфологию. Часть из них может даже образовывать ассоциации с атипическими клетками. В нативных препаратах в некоторых из этих комплексов можно увидеть клетки реснитчатого эпителия, реснички которых находятся в мерцательном движении. Закономерное увеличение содержания клеток бронхиального эпителия в мокроте отмечается после бронхоскопии.

Достаточно редко можно видеть в мокроте гигантские клетки Пирогова-Лангханса и эпителиоидные клетки, что встречается не только при туберкулезе, но и при саркоидозе Бека (болезнь Бенье-Бох-Шаумана). Значительно чаще в препаратах присутствуют многоядерные легочные макрофаги, которые также относятся к клеткам специфической гранулемы.

Правильно выполненное исследование промывных вод бронхов больных, которые не выделяют мокроту, обладает такой же эффективностью, как и исследование мокроты.

При туберкулезе легких нет характерной цитологической картины содержимого бронхов. Взятие материала непосредственно из пораженных участков бронха позволяет выявлять в части случаев элементы туберкулезной гранулемы.

Исследования пунктатов лимфатических узлов

Е.Д.Тимашев (1953) выделил 5 стадий туберкулезного лимфаденита на основании сопоставления цитологических, гистологических и клинических данных.

На первой стадии - гиперпластической - характерные для туберкулеза клеточные элементы еще отсутствуют. Если лимфоузел выявлен в сроки менее одного месяца, повторную пункцию назначают через 2-3 нед.

Вторая стадия - гранулематозная. На фоне гиперплазии лимфоидной ткани развиваются туберкулезные бугорки. Расположение специфической ткани в пораженном лимфоузле имеет гнездный характер, поэтому не всегда при первой пункции удается получить диагностически информативный материал. В удачно взятом пунктате видны все элементы туберкулезной гранулемы.

Третья стадия характеризуется массивным казеозным распадом ткани лимфатического узла. В пунктате - беловатого цвета субстрат творожистой или крошковатой консистенции. Микроскопически в мазках - фиолетового цвета детрит, состоящий из глыбок и островков, которые представляют собой остатки распавшихся клеток. Вишневого цвета крапчатость обусловлена остатками ядерного хроматина. При обызвествлении лимфатического узла препарат дополнительно содержит большое количество бесцветных кристаллов солей.

Аналогичный распад ткани по типу творожистого некроза наблюдается также при злокачественных опухолях и при лимфогрануломатозе. Для подтверждения туберкулезного характера поражения необходимо найти среди детрита сохранившиеся лимфоидные клетки, в то время как при новообразованиях в детрите присутствуют клетки злокачественной опухоли. Вместе с тем, лимфоидные клетки обнаруживаются в пунктатах и при лимфогрануломатозе, и при некоторых разновидностях ретикулосарком, в то время как характерные для этих заболеваний патологические элементы полностью распадаются.

Четвертая стадия - гнойное расплавление лимфатического узла. Пунктат - гной. Положительный результат выдается при обнаружении в гное элементов туберкулезной гранулемы и/или микобактерий туберкулеза.

Пятая стадия - фиброзная - характеризуется значительным уменьшением и уплотнением пораженного лимфатического узла вследствие развития фиброза. Пунктат зачастую получить не удается, или материал очень скуден. Иногда в пунктат может попасть небольшое количество уплотнившегося казеоза, еще реже - другие элементы туберкулезной гранулемы.

Исследование соскобов стенки свища при туберкулезных поражениях различной локализации

Содержимое соскоба стенки свища обычно имеет характерную для неспецифического воспаления морфологию "активного" гноя с содержанием клеток ретикуло-гистиоцитарного ряда и клеток регенерационной ткани. Если поражение обусловлено туберкулезным поцессом, то в препарате обнаруживаются элементы туберкулезной гранулемы: эпителиоидные клетки и гигантские клетки Пирогова - Лангханса.