Нитраты

1.3.Получение растений-регенерантов, устойчивых к абиотическим вредным факторам методами клеточной инженерии.

С помощью  различных методов биотехнологии  стало возможным получение устойчивых растений к широкому спектру абиотических стрессовых факторов: засолению, к токсическим  концентрациям тяжелых металлов, к осмотическому стрессу, воздействию  засухи и повышенных температур. Стрессовые воздействия окружающей среды угнетают рост и развитие растений, снижая их продуктивность. Важными задачами для  современной биотехнологии и  селекции является повышение устойчивости сельскохозяйственных растений к засухе, засолению, заморозкам и другим неблагоприятным  средовым воздействиям.

Засуха. Недостаток воды в почве наносит  значительно больший урон растениеводству, чем все остальные стрессовые факторы, вместе взятые. Засуха приводит к возникновению водного дефицита в почве и соответственно в  растениях, вызывая у них водный стресс. Хотя термин «засуха» относится  главным образом к почвенному водному стрессу, он включает также  воздействие жары на растения. Стресс, вызванный водным дефицитом, может быть первичным в случае засухи, а также вторичным при низкотемпературном, тепловом или солевом стрессах. Стресс, вызванный засухой, ведет к прямым или непрямым повреждениям растений, которые обусловлены инактивацией ферментов, нарушением биохимических путей, накоплением токсических веществ, утечкой ионов, дефицитом питания и другими причинами.[7]

 С  целью имитации in vitro стрессового эффекта засухи могут применяться питательные среды, которые дополнены осмотически активными веществами, понижающими внешний водный потенциал. В качестве такого селективного агента, для селекции на устойчивость к засухе были использованы полиэтиленгликоль (ПЭГ), представляющий собой непроникающее в клетку осмотически активное вещество. Первое сообщение о выделении клеточных линий табака, устойчивых к стрессу, индуцированному ПЭГ, появилось в 1979 г. (Heyser, Nabors, 1979). Позже для селекции на засухоустойчивость Р. Брессан с соавт. использовал клеточные линии томата, которые подвергались водному стрессу при культивировании каллусной ткани в присутствии ПЭГ 6000 в концентрации 15 %. В результате опытов были отобраны устойчивые каллусные линии, однако устойчивость быстро терялась при культивировании каллуса на среде без осмотика, что указывает на физиологическую природу адаптации. Тестирование каллусных линий на рост в присутствии ПЭГ предложено для идентификации выносливых к засухе генотипов сои. Анализ роста каллусных тканей десяти сортов сои на средах с 0,15, 20 % ПЭГ 8000 свидетельствовал о корреляции засухоустойчивости у растений и толерантности к ПЭГ культивируемых клеток. Для получения адаптированных к водному стрессу клеточных линий также применялись среды, содержащие в качестве осмотика 99—880 мМ маннитол. Как и в предыдущем случае, осмотически адаптированные клетки обладали повышенной выносливостью к солевому стрессу. [7]

Засоление. Одним из лимитирующих факторов сельскохозяйственной продуктивности является засоление почв. Около 900 млн. га всех земель нашей планеты имеют повышенное содержание солей, а количество засоленных почв с каждым годом возрастает. Особую тревогу вызывает увеличение в почвах содержания солей, которое происходит в результате их искусственного орошения. Решение данной проблемы во многом зависит от разработки рациональных агротехнических приемов, правильной методологии орошения, использования для полива частично или полностью обессоленной воды. С развитием биотехнологии растений потенциально возможным является получение солевыносливых генотипов у важных сельскохозяйственных культур путем селекции на уровне соматических клеток, слияния протопластов или переноса генов при использовании техники рекомбинантных молекул ДНК. [7]

Вредное действие засоления имеет комплексный  характер и обусловлено как нарушением осмотического баланса клетки, так и прямым токсическим влиянием ионов натрия, хлора на физиологические и биохимические процессы в клетке. Результатом такого действия может быть уменьшение тургора клетки, ингибирование функции мембран и активности ферментов, подавление фотосинтеза, нехватки отдельных ионов из-за нарушения селективного транспорта ионов, использование значительного количества энергии для поддержания толерантности. Основные типы реакций растений, возникающие в ответ на повышение концентрации солей во внешней среде.

Экспериментальные данные, полученные многими учеными, показывают, что клеточные механизмы выносливости к засолению являются сходными для культивируемых in vitro клеток и целых растений и что селекция на клеточном уровне представляет реальную перспективу получения устойчивых к засолению форм растений. [8]

Большинство селекционных программ направлены на выделение in vitro клеточных линий, толерантных к присутствию в среде для культивирования клеток хлорида натрия. Так, показано, что выращивая гаплоидные каллусные клетки табака на среде с постоянно увеличивающейся концентрацией солей, получены клеточные линии, способные к росту в присутствии 1 % NaCl. M. Наборе с соав. предварительно обработав суспензионную культуру табака мутагеном (0,15 % ЭМС, 60 мин), путем одноступенчатой селекции выделили клеточные линии, устойчивые к 0,5 % NaCl. Отмечено, что выносливость, полученных регенерантов к засолению, проявлялась на уровне целых растений.

Солевыносливость  растений удается также повысить в результате селекции к одному фактору засоления осмотическому стрессу. Например, клетки томата, адаптированные к водному стрессу, индуцированному полиэтиленгликолем, обладали повышенной устойчивостью к NaС1. Повышенная толерантность к соли обнаружена у клеточных линий моркови, отобранных на среде, содержащей в качестве осмотика маннитол в высокой концентрации (99—870 мМ). Из этих результатов следует, что адаптация клеток к осмотическому стрессу применима для отбора солевыносливых вариантов, а исследования подобного рода представляют интерес для изучения как во взаимодействии, так и независимо друг от друга.

Металлы. Присутствие в почве в большом  количестве ионов металлов, токсически влияющих на растения, или недостаток ионов, используемых растениями в качестве питательных веществ, могут быть причиной ионного (минерального) стресса у растений. Особое внимание ученых привлекает изучение стрессов, обусловленных наличием в почве ионов тяжелых металлов, многие из которых токсически влияют как на растительные, так и на животные организмы. Стрессовое состояние у растений может быть индуцировано ионами таких тяжелых металлов, как цинк, кадмий, медь, ртуть; они также довольно часто встречаются и в почвах, механизмы устойчивости к токсическим ионам могут исключать уменьшение проницаемости плазмалеммы, детоксикацию ионов в результате связывания с органическими веществами, компартментализацию в вакуолях, а также изменения структуры ферментов, которые являются их мишенями..[8]

Работы  по клеточной селекции растений на устойчивость к ионным стрессам начаты недавно, но уже имеют положительный  результат. Во всех экспериментах используется метод прямой селекции, при котором  в качестве селективного агента применяли  токсические концентрации солей. Однако создание стрессовых селективных условий in vitro, идентичных таковым в природе, крайне затруднительно. В природных условиях помимо токсического действия ионов накладываются другие факторы, в частности наличие различных веществ, кислотность почвы и т. д. Для селекции на клеточном уровне используют питательные среды, которые хотя не полностью соответствовали естественным стрессовым условиям, все же обеспечивали экспрессию признака устойчивости и давали возможность отбирать нужные варианты. [9]

Путем прямой селекции in vitro отобраны клеточные линии петунии, устойчивые к ртути, сорго—к алюминию, моркови — к алюминию и марганцу одновременно; суспензионные клеточные культуры дурмана — к кадмию. На кафедре сельскохозяйственной биотехнологии МСХА также проводились работы по получению клеточных линий и растений-регенерантов льна-долгунца, устойчивых к соли нитрата кадмия и изучалось действие этой соли на интактные растения. Экспериментально показано, что присутствие ионов кадмия в почве приводит к торможению роста стеблевой и корневой частей растения, к сокращению на 7—9 дней онтогенетических фаз развития, следующих за фазой «елочки» по сравнению с контролем, культурные виды накапливают ионы кадмия в вегетативной массе, в то время как дикие — нет. Мезо- и ультраструктурный анализ стеблей льна-долгунца показал, что присутствие кадмия в субстрате приводило к уменьшению количества клеток элементарных волоконец в пучке, к некомпактному расположению клеток элементарных волоконец в лубяных пучках, а также к формированию клеток элементарных волоконец неодинаковых размеров в пределах одного пучка и к различным срокам формирования вторичной клеточной стенки. В результате клеточной селекции были получены растения-регенеранты, обладающие устойчивостью к соли кадмия.[9]

Экстремальные температуры. Причиной стрессового фактора у растений могут быть относительно высокие или низкие температуры. Работ по клеточной селекции на устойчивость к этим стрессам немного. В изученной нами литературе сведений о клеточной селекции к тепловому шоку не обнаружено, хотя белки теплового шока являются предметом пристального изучения биологов различного профиля. Что касается работ по клеточной селекции к низкотемпературным факторам, то они имеют место.

Холодовой стресс у растений может быть вызван температурами большого диапазона: от 10—15° до 0°С. Такому стрессу наиболее подвержены растения тропических и субтропических зон. Стойкость растений к охлаждению обусловлена способностью липидов мембран оставаться в жидком состоянии благодаря наличию большой пропорции ненасыщенных жирных кислот и/или повышенного содержания стеролов. Повреждения, вызванные промораживанием растений (температура ниже 0°С) связаны прежде всего с формированием внеклеточного льда. При этом отток воды во внеклеточное пространство приводит к вторичному эффекту, вызванному водным стрессом. Нарушения, вызываемые отрицательными температурами, могут быть предотвращены аккумуляцией антифризных веществ, уменьшением количества несвязанной воды при обезвоживании и увеличением способности переохлаждаться. Большинство авторов отмечают, что у растений происходят глубокие превращения запасных питательных веществ, в частности, у морозоустойчивых древесных растений накопление большого количества жиров, а у менее устойчивых — Сахаров.

Первые  эксперименты, в которых описана  возможность использования культивируемых растительных клеток для отбора выносливых к низким температурам клеточных линий, опубликованы в 1976 г. (Dix, Street, 1976). Работы проводились на суспензионных культурах табака и перца, которые после высева на агаризованные среды подвергались в течение 21 дня соответственно температурам — 3° и 4°С. Среди отобранных клонов обнаружены линии, стабильно сохраняющие повышенную холодоустойчивость.

Основываясь на имеющихся в этой области исследований данных, однозначный ответ о применимости прямой селекции in vitro растений, выносливых к низкой температуре, давать пока рано. Несомненно, однако, что индукция in vitro генетического разнообразия найдет применение для отбора более выносливых вариантов. [10]

1.4.  Применение нитратов

      Азотные удобрения: Проблема повышенного  содержания нитратов в некоторых видах овощей и продуктах питания иногда упрощается применением азотных удобрений. Очень часто виновником всё ухудшающихся условий окружающей среды считают химию. Этому в немалой степени способствует появление многочисленных сообщений в средствах массовой информации, которые порой носят субъективный характер и недостаточно научно обоснованы. Действительно, продукты химического производства любого вида чужды природе. Однако следует иметь в виду, что дальнейшее развитие человеческого общества без химии немыслимо. Вся проблема состоит в том, чтобы правильно её использовать для нужд человечества.

      Накопление нитратов в растениях  – следствие чрезмерного содержания азота в почве. Внесение большого количества азотных удобрений, что часто имеет место, уже не способствует соответствующему повышению урожая, но зато значительно ухудшает  питательную, технологическую и гигиеническую ценность продуктов, осложняет послеуборочную их обработку и хранение. Кроме того, переудобрение почвы азотом сопровождается всё возрастающим загрязнением воды. Эта проблема остро стоит сейчас во всём мире.[11]

      Отрицательные явления имеют  место в том случае, если растения поглощают избыточное количество азота, которое они в силу своих генетических особенностей или других причин не в состоянии использовать обычным физиологическим путём. В связи с эти необходимо систематически контролировать содержание азота в почве и поддерживать его на должном уровне путём правильного применения приёмов технологии. Это один из важнейших критериев дальнейшего развития сельского хозяйства и производства.

      При производстве овощей в  первую очередь следует предусматривать оптимизацию дозы вносимых удобрений, сроков их применения и формы использования. Внесение азота в почву следует регулировать не только в зависимости от содержания его в почве на данный момент, но и от предполагаемой эффективности использования. Наука настойчиво рекомендует и доказывает необходимость использования азотных удобрений в разумных пределах, однако на практике эти рекомендации не выдерживаются.

      В период роста и развития  растений происходит большое  потребление азота, недостаток которого сильно угнетает их. Исключительная роль азота для растений и всего живого на земле определяется прежде всего  тем, что он входит в состав белков (16-18 %) и хлорофилла, без которого невозможна важнейшая функция зелёного растения – фотосинтез. Не менее важна его роль в образовании многих витаминов.

      Растения недостаточно обеспеченные  азотом, слабо растут, имеют светло-

зелёную или  даже желтоватую окраску. Вегетативное развитие заканчивается раньше обычного и растения выглядят физиологически более старыми. Нормальное же снабжение растений азотом повышает содержание хлорофилла и интенсивность фотосинтеза, увеличивает ассимиляционную поверхность листьев и срок их жизни. Влияет этот элемент и на процессы водообмена в растениях. Поэтому овощные растения нуждаются, в первую очередь, в азотных удобрениях, поскольку почва лучше обеспечена фосфором и калием, чем азотом. Избыточное несбалансированное питание азотом способствует накоплению в овощах вредных для здоровья людей нитратов и нитритов.[11]