Биологическая характеристика escherichia

При электронно-микроскопическом исследовании на поверхности бактериальной клетки Е. coli видны как жгутики, так и пили. Жгутики снабжены чехлом и волнообразно изогнуты. Пили лишены чехла и не изогнуты. Они прикрепляются под цитоплазматической мембраной  и поэтому сохраняются на протопластах. Пили F-типа адсорбируют на своей поверхности фаговые частицы.

Штаммы, имеющие жгутики, способны передвигаться. Жгутики расположены перитрихально. На конце жгутика расположен белок FimH, который прикрепляется к молекулам сахаров на поверхности, а сам жгутик состоит из цепочки взаимосвязанных белковых сегментов, закрученных в форме тонкой длинной пружины и упруго вытягивающихся при воздействии силы.

На ультратонких срезах у некоторых штаммов Е. coli на поверхности клетки обнаруживается микрокапсула. Однако чаще микрокапсула не выражена, а поверхность клеточной стенки или гладкая, или слегка шероховатая из-за наличия электронноплотного материала глыбчатой или фибриллярной структуры.

Под наружной мембраной расположен слой, также относящийся к клеточной стенке. Этот слой имеет перегородчатое или бахромчатое строение. На лизированых или частично лизированых клетках он имеет вид тонкого контура, расположенного под наружной мембраной.

Цитоплазматическая мембрана образует кольцевидные инвагинаты в сторону цитоплазмы. Сложно устроенные мембранные структуры у Е. coli обычно можно наблюдать только в лизированых клетках или в клетках, подвергавшихся действию осмотического шока. В первом случае они расположены в цитоплазме, во втором – в пространстве между клеточной стенкой и цитоплазматической мембраной. Основная часть цитоплазмы плотно заполнена гранулярным компонентом.

Нуклеоид обычно отчетливо отграничен от остальной части цитоплазмы и заполнен фибриллами ДНК диаметром 25-30 А.

Клетки Е. coli делятся путем перетяжки, так же как и клетки других грамотрицательных бактерий. В начальных стадиях деления клетки происходит перешнуровка нуклеоида и образование петлеобразных инвагинатов цитоплазматической мембраны в месте будущей перетяжки[7].

 

 

 

2.2 Методы окраски, специальные методы окраски E. coli

 

Окраску мазка производят простыми или сложными методами. Простые заключаются в окраске препарата одним красителем; сложные методы (по Граму, Цилю-Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и имеют дифференциально-диагностическое значение. Отношение микроорганизмов к красителям расценивают как тинкториальные свойства. Существуют специальные методы окраски, которые используют для выявления жгутиков, клеточной стенки, нуклеоида и разных цитоплазматических включений.

При простых методах мазок окрашивают каким-либо одним красителем, используя красители анилинового ряда (основные или кислые). Если красящий ион (хромофор) – катион, то краситель обладает основными свойствами, если хромофор – анион, то краситель имеет кислые свойства. Кислые красители – эритрозин, кислый фуксин, эозин. Основные красители – генциановый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, метиленовый синий, основной фуксин. Преимущественно для окраски микроорганизмов используют основные красители, которые более интенсивно связываются кислыми компонентами клетки. Из сухих красителей, продающихся в виде порошков, готовят насыщенные спиртовые растворы, а из них – водно-спиртовые, которые и служат для окрашивания микробных клеток. Микроорганизмы окрашивают, наливая краситель на поверхность мазка на определенное время. Окраску основным фуксином ведут в течение 2 мин, метиленовым синим – 5-7 мин. Затем мазок промывают водой до тех пор, пока стекающие струи воды не станут бесцветными, высушивают осторожным промоканием фильтровальной бумагой и микроскопируют в иммерсионной системе. Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения совершенно прозрачно, а клетки интенсивно окрашены.

Сложные методы окраски применяют для изучения структуры клетки и дифференциации микроорганизмов. Окрашенные мазки микроскопируют в иммерсионной системе. Последовательно нанести на препарат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету, протравы, спирты, кислоту и др.

При простых методах окраски используется лишь одна краска.

С этой целью в бактериологии используются, как правило, или водный фуксин или метиленовая синька. Простые методы окраски используются для ориентировочной, предварительной, микроскопии – определения наличия в патологическом материале бактерий, определение их формы и расположения в мазке.

При сложных методах окраски используются ряд красок в определенной последовательности. Такие методы используются для выявления в патологическом материале конкретных микроорганизмов, а также определения особенностей их ультраструктуры.

1. Окраска по Граму используется для определения типа строения клеточной стенки. Это основной метод в бактериологии. В зависимости от окраски по Грамму все бактерии подразделяются на грамположительные и грамотрицательные.

2. Окраска по Цилю-Нильсену используется для выявления кислотоустойчивых бактерий (а именно – микобактерий), а также для обнаружения спор.

3. Окраска по Нейссеру используется для выявления цитоплазматических включений волютина и идентификации по их наличию коринебактерий (в частности – возбудителей дифтерии).

4. Окраска по Бури-Гинсу используется для выявления макрокапсул.

5. Окраска по Морозову  используется для выявления жгутиков. Этот метод окраски используется  также для выявления трепонем. Кроме того, окраску по Морозову  используют в вирусологии –  для выявления в оспенных пузырьках  вирусов натуральной и ветряной  оспы.

6. Окраска по Здрадовскому используется для выявления риккетсий и хламидий.

7. Окраска по Романовскому-Гимзе также, наряду с окраской по Здрадовскому, используется для выявления риккетсий и хламидий; кроме того, этот метод окраски используется для выявления спирохет (с их идентификацией до рода в зависимости от цвета окрашивания), а также для выявления простейших.

 

 

2.3 Специальный  метод окраски E. Coli

 

Возбудители кишечных инфекций относятся к нескольким семействам, все представители которых являются грамотрицательными, неспорообразующими палочками, имеют сходную морфологию и с трудом различаются бактериоскопически, поэтому они хорошо окрашиваются анилиновыми красителями. Идентификацию этих возбудителей лучше всего проводить иммуноцитохимически либо с помощью иммунолюминесцентного или иммуноферментного метода. Холерные вибрионы выявляют как с помощью анилиновых красителей типа метиленового синего, так и иммунолюминесцентным способом с препаратами люминесцирующих антихолерных антител.

Основным методом окраски мазков E. coli является окрашивание по Граму.

Окраска по Граму

Красящие растворы. Раствор кристаллического фиолетового по Эрлиху: 1,2 г кристаллического фиолетового растворяют в 12 мл 96 % спирта и добавляют 100 мл свежеприготовленной анилиновой воды, полученной при смешивании 2 мл анилина со 100 мл воды. Эта красящая смесь может храниться 2 нед. Вместо кристаллического фиолетового можно использовать метиловый фиолетовый.

Красящие смеси для грамотрицательных бактерий:

1) 8-9 г основного фуксина + 100 мл 96 % спирта;

2) 1 мл насыщенного спиртового  раствора основного фуксина + 10 мл  дистиллированной воды;

3) 1 г основного фуксина +1 г фенола + 0,5 мл глицерина + 10 мл 96 % спирта +100 мл дистиллированной  воды;

4) 0,2-0,5 % водный раствор сафранина либо 0,25 % раствор сафранина в 10 % спирте.

Методика окраски.

1. Мазки крови, цереброспинальной  жидкости, экссудатов фиксируют  над пламенем горелки (быстро  проводят 3 раза над пламенем, так  чтобы мазок прогревался до 70-800С  в течение 3-4 с), затем высушивают. Кроме фиксации над огнем, для  мазков применима фиксация в  метиловом спирте (5 мин) или в  парах формалина (в сосуде Коплина) в течение 15 мин.

2. Наливают на фиксированный  мазок карболовый или анилиновый  генциановый фиолетовый (или кристаллический фиолетовый) на 2--3 минуты. Во избежании осадков окрашивают через фильтровальную бумагу. Очень удобно работать с полосками фильтровальной бумаги, предварительно пропитанной 1% спиртовым раствором одного из вышеуказанных красителей и затем высушенной. Такую окрашенную и высушенную бумагу накладывают на мазок и смачивают дистиллированной водой. Продолжительность окрашивания остается прежней (2-3 мин.).

3. Сливают краску, аккуратно  удаляют фильтровальную бумагу  и быстро споласкивают в водопроводной  воде (15-30 секунд).

4. Мазок заливают на 1-2 мин раствором Люголя иди другим йодистым раствором, например по Граму (2 г йодида калия растворяют в 2-3 мл дистиллированной воды, добавляют 1 г кристаллического йода, доливают до 300 мл, а по Вейгерту до 100 мл дистиллированной воды).

5. Раствор сливают, мазок  промывают водой (водопроводной  или дистилированной).

6. Дифференцируют 96° спиртом, наливая и сливая его, пока  отходит синяя краска и не  обесцветится мазок (приблизительно 20-40-60 секунд). Во время дифференцировки  препарат все время покачивают.

Если вместо спирта использовать ацетон, то промывание продолжается 30 с. Можно дифференцировать смесью спирта и ацетона (1:1) 30 с.

7. Промывают стекла в  проточной или дистиллированной воде 1-2 мин.

8. Дополнительно окрашивают (для выявления грамотрицательной  группы бактерий) либо 0,5% водным  раствором нейтрального красного (нейтральрот), либо разведенным (в 10 раз) карболфуксином Циля – 1-2-3 минуты. Возможна докраска сафранином (0,2-0,5 % водный раствор или 0,25 % раствор в 10 % спирте) основным коричневым (бисмаркбраун) либо пиронином J или В (2-5 мин).

9. Промывают в проточной  воде 5 с и высушивают фильтровальной  бумагой.

Результат: Грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный или коричневый в зависимости от красителя; ядра клеток – ярко-красные, цитоплазма – розовая.

Следует заметить, что в классической прописи при окраске по Граму обычно не промывают мазки в воде ни после окраски генциановым фиолетовым (кристаллическим фиолетовым), ни после обработки раствором Люголя, ограничиваются лишь сливанием растворов. Предлагаемое промывание в воде имеет целью только чистоту в работе, тем более, что оно ни в какой мере не отражается на результатах окрашивания.

 

 

ГЛАВА 3.

КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА

 

Эшерихии – факультативные анаэробы, хорошо растут на обычных простых и синтетических питательных средах при температуре от 15° до 46°С. Оптимальная температура для роста – 37-38°С. Хорошо растут при рН среды, близком к нейтральной реакции (7,2-7,4). На плотных питательных средах Е. coli образуют круглые выпуклые колонии средней величины, влажные, с гладкой блестящей поверхностью с ровным краем (S-форма) или плоские, сухие со слегка волнистым краем и шероховатой поверхностью (R-форма). В жидких средах эшерихии растут в виде интенсивного равномерного помутнения среды, образуя осадок, иногда пленку на поверхности или кольца на стенке пробирки. Осадок разбивается при встряхивании, образуя гомогенную взвесь. На селективно-дифференциальной среде Эндо лактозоположительные штаммы образуют колонии малиново-красного цвета с металлическим блеском или без него. На агаре Левина (среда с эозином и метиленовым синим) – колонии темно-фиолетового цвета. Бактерии, не ферментирующие или замедленно ферментирующие лактозу, на среде Эндо формируют сероватые колонии и светло-розовые – на агаре Левина.

На сорбитол агаре абсолютное большинство эшерихий образуют колонии красного цвета как на среде Эндо. Исключением являются бактерии серовара О157:Н7, не изменяющие цвет среды и образующие сероватые колонии[9].

 

ГЛАВА 4.

АНТИГЕННАЯ СТРУКТУРА И ФАКТОРЫ ПАТОГЕННОСТИ

 

4.1 Антигены, вариабельность 

 

Общепризнанная серологическая классификация эшерихий, разработанная Ф. Кауфманом (1959), основана на анализе О-, К- и Н-антигенов.

В 1963 году было установлено 146 вариантов О-антигенов, 88 вариантов К-антигенов, до конца 80-х годов у эшерихий была известна 171 серологическая разновидность О-антигенов, более 100 разновидностей К-антигенов и 60 разновидностей Н-антигенов[10].

По данным В.И. Покровского[11], в настоящее время установлено 173 О-серогруппы и 56 типов Н-антигена E.coli, а также около 80-ти типов Н-антигенов, однако лишь незначительная часть способна вызывать кишечные инфекции у животных и человека.

О-антигены – термостабильные соматические, не разрушаются при температуре 100°С в течение 2 часов и от действия алкоголя. По химической природе они представляют липополисахаридно-белковый комплекс, который определяет серогрупповую специфичность штаммов и содержится в клеточной стенке. Разные серологические группы эшерихий отличаются друг от друга по углеводному составу полисахаридов.

К-антигены – поверхностные или капсульные, обозначаемые L, В и А. Большая часть их – кислые полисахариды, но имеются штаммы белковой природы (L-антигены) или различного химического состава. L-антигены термолабильны, разрушаются при 100°С в течение одного часа. В-антиген термолабилен, при 100°С утрачивает антигенные свойства, но сохраняет агглютинабельность.

А-антиген (капсульный) термостабильный, при 100°С не разрушается в течение 2,5 часов.

Н-антиген (жгутиковый) содержится у подвижных штаммов эшерихий, термолабильный, белковой природы. Один и тот же Н-антиген может встречаться у бактерий разных серогрупп.

Поверхностные (L, В, А) антигены препятствуют агглютинации бактерий соответствующей О-сывороткой, поэтому при серогрупповой типизации культур эшерихий их подвергают термической обработке: прогреванию в водяной бане или автоклавированию.

Сочетание О-, К- и Н-антигенов характеризует серологический варант бактерий.

Согласно международной договоренности о порядке размещения символов в антигенной формуле, на первое место ставится показатель О, на второе К и на третье Н. В антигенной формуле эти группы разделяются между собой двоеточием и каждая из них имеет порядковый номер арабскими цифрами. По антигенным формулам устанавливается принадлежность исследованного штамма к определённой серологической группе[12].