Биологический микрочип. ДНК-микрочипы

3МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ і науки, МОЛОДІ ТА СПОРТУ УКРАЇНИ  НТУУ  “КПІ”

Національний технічний університет України «КПІ»

 

 

 

                                                        Факультет біотехнології і біотехніки

                                                               Кафедра промислової біотехнології

 

 

 

 

Реферат

з курсу «Медичні біотехнології»

на тему: «Биологический микрочип. ДНК-микрочипы»

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Керівник:                                                                        Виконали:

Горчаков В.Ю.                                                                 студентки 3-го курсу,

ФБТ

Допущений до захисту: групи  БТ-31с

“___” _________20__р. Пєскова Л.О., Савченко А.А.

Захищено з оцінкою: 

 

 

 

 

 

 

КИЇВ – 2013

СОДЕРЖАНИЕ

 

ВСТУП

1. ДНК-микрочипы
2. Технология синтеза биочипов
1. Технология синтезу in situ
2. Технология синтезу non in situ
3. Детекция результатов гибридизации
1. Радиоизотопная детекция
2. Флуоресцентная детекция
3. Спектроскопические методы
4. Электрохимические методы
4. Применение биочипов

 

ВЫВОДЫ

 

 

ВВЕДЕНИЕ

 

Биологические микрочипы (biochips) или, как их чаще называют —microarrays, — это один из новейших инструментов биологии и медицины 21 века. Изобретены биочипы были в конце 90-х годов в России и в США. Технология микрочипов – это принципиально новый уровень лабораторных исследований, так как она позволяет проводить одновременное тестирование тысяч образцов [1].

Существует два основных типа биочипов. Первый тип - исследовательские чипы – это микроматрицы различных соединений, главным образом биополимеров, иммобилизованных на поверхности стекла, в микрокаплях геля, в микрокапиллярах [2]. Тысячи молекул ДНК или белков помещаются на стеклянные пластинки для создания ДНК- и белковых чипов соответственно [1]. Для анализа результатов, полученных с помощью таких чипов, требуются серьезные программные комплексы, которые общитывают полученные данные и специальные знания, как вычленить нужный результат [3].

Другим типом биочипов, или диагностические чипы – являются миниатюризованные "микролаборатории" [2]. Диагностические чипы применяются в медицинской практике. От исследовательских чипов они отличаются количеством точек, которых здесь гораздо меньше (от десятка до нескольких сотен) и точностью — она значительно выше, чем у исследовательских [3].

.Эффективность биочипов обусловлена возможностью параллельного проведения огромного количества специфических реакций и взаимодействий молекул биополимеров, таких как ДНК, белки, полисахариды, друг с другом и низкомолекулярными лигандами. Удается в достаточно простых параллельных экспериментах собрать и обработать на отдельных элементах биочипа огромное количество биологической информации. В этом заключается фундаментальное информационное сходство биочипов с электронными микрочипами. Однако между ними имеется и ряд принципиальных различий [2].

К главным причинам широкого распространения биочиповых исследований относят высокую чувствительность, специфичность и воспроизводимость, простоту процедуры выполнения, возможность одновременного анализа множества параметров и относительно невысокую стоимость работ. Эти же причины заставляют рассматривать биочипы как перспективный инструмент в различных областях народного хозяйства [1].

 

 

1. ДНК-МИКРОЧИПЫ

 

ДНК–чипы представляют собой уникальный аналитический инструмент, позволяющий определять наличие в анализируемом образце (как правило, биологического происхождения) заданных последовательностей ДНК (т.н. гибридизационный анализ) [1].

Макроматрицы ДНК и белков иммобилизованных на фильтре, или фиксированных в лунках планшет, были известны достаточно давно. Однако первая работа по ДНКовым микрочипам в современном формате были опубликованы лабораторией в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (ИМБ) [2].

Проведение анализа с помощью ДНК–чипов обходится в несколько раз дешевле, чем при использовании альтернативных технологий (электрофорез, ПЦР в реальном времени) и допускает, при наличии детектора несложной конструкции, работу вне лаборатории.

Впервые ДНК–чипы были использованы в исследованиях в конце 80-х годов прошлого века. В основе этого теперь уже широко распространенного метода, позволяющего одновременно анализировать экспрессию множества генов, лежит принцип узнавания мРНК-овых или кДНК-овых мишеней посредством их гибридизации с иммобилизованными на микрочипе одноцепочечными фрагментами ДНК.

ДНК–микрочип представляет собой твердую подложку, на которой иммобилизованы (как правило, ковалентно) однонитевые фрагменты ДНК разной длины: короткие – 15-25 нуклеотидов, длинные – 25-60 нуклеотидов и кДНК фрагменты – от 100 до 3000 нуклеотидов. В качестве материала подложки используют стекло, кремний, различные полимеры, гидрогели (например, на основе полиакриламида) и даже золото.

На основании экспериментальных данных сотрудниками лаборатории клеточной инженерии под руководством д.б.н. Белецкого И. П. Института Теоретической и Экспериментальной Биофизики (г. Пущино Московская обл.) была разработана технология для крупномасштабного изготовления стеклянных подложек при производстве ДНК-чипов, а также их использования при гибридизационном анализе ДНК [1].

Организованное размещение однонитевых ДНК занимает на платформе очень небольшой участок размером от почтовой марки до визитной карточки, поэтому в названии биочипов присутствует слово micro. Микроскопический размер биочипа позволяет размещать на небольшой площади огромное количество разных молекул ДНК и считывать с этой площади информация с помощью флуоресцентного микроскопа или специального лазерного устройства для чтения [4].

ДНК наносится на него методом машинной микропечати и химической пришивки в виде множества упорядоченных точек, каждая из которых содержит равное количество синтезированных ДНК-фрагментов,  имеющих уникальную последовательность. В других технологиях гибридизационного анализа генов комплементарные фрагменты ДНК пришивают к поверхности микроскопических шариков [6].

 

2. ТЕХНОЛОГИЯ СИНТЕЗA БИОЧИПОВ

 

2.1. Технологія синтезу in situ

Наиболее прогрессивное направление в синтезе ДНК-чипов - это синтез олигонуклеотидов непосредственно на поверхности чипа ('on-chip') путем поэтапного добавления нуклеотидов к растущему концу цепи. Это направление более эффективно, чем использование предварительно синтезированных полинуклеотидов, так как предполагает возможность одновременного синтеза всех полинуклеотидов, размещаемых на чипе.

Существуют два подхода синтеза чипов in situ: последовательный и параллельный.

Последовательный подход предусматривает использование обычного фосфорамидитного метода синтеза полинуклеотидов. При этом реагенты (5' защищенные - 3' фосфорамидитактивированные нуклеотиды) наносятся на необходимые точки (ячейки чипа).  

Преимуществом такого подхода является его простота, отсутствие необходимости в сложном оборудовании. Но эта группа методов имеет существенные недостатки, обусловленные невозможностью одновременного синтеза большого количества нуклеотидов. Лимитирующим фактором здесь является проблема доставки активированных нуклеотидов в определённую точку поверхности чипа. Таким образом, метод требует доставки готовых мономеров к месту сборки полимерной цепи. Необходимость адресации мономеров связана с тем, что все растущие полинуклеотидные цепи при использовании этого метода одинаковы по своей возможности присоединить нуклеотид. То есть любой иммобилизованный полинуклеотид может в стадию присоединения быть соединён с любым нуклеотидом, находящимся в растворе. Поэтому и возникает необходимость пространственно разграничить участки присоединения каждого мономера.

Путей решения этой проблемы принципиально возможно всего два:

1) перемещение мономеров к поверхности  чипа из резервуаров по специальным  каналам, выпускные отверстия, в  которых непосредственно контактируют  с поверхностью чипа. Для обеспечения  эффективного синтеза необходимо  наличие максимального количества  каналов, каждый из которых должен  быть соединён со всеми четырьмя  резервуарами, как минимум 4. Для  управления клапанами также должна  быть использована соответствующая, обычно электромеханическая, система. Одновременно может быть открыт  только один из 4-х клапанов, соответствующий  тому резервуару, в котором находится  мономер, необходимый для депонирования  в этой точке чипа в данном  цикле.

Преимущества: возможность одновременного синтеза нескольких нуклеотидов, количество которых равно количеству каналов размещающего устройства.

Недостатки: сложность размещающего устройства, необходимость создания трёхмерной сети каналов.

2) размещении мономеров с помощью  подвижного диспенсера, который  перемещается в плоскости чипа  и дистанционно наносит капли  материала на соответствующие  участки чипа. Например, с помощью  специального пьезоэлектрического микроинъектора (ink-jet) перемещаемого в плоскости чипа специальным манипулятором. Одного наполнения реагентом достаточно для присоединения одного нуклеотида ко всем имеющимся на чипе олигонуклеотидам, где этот нуклеотид должен находиться в данной позиции. Таким образом, для удлинения всех олигонуклеотидов на 1 позицию необходимо 4 цикла. Всего для синтеза чипа необходимо 4 x n циклов, где n - длина олигонуклеотида.  

Преимущества: доступность, поскольку для его осуществления требуется только соответствующий принтер с использованием ink-jet технологии.

Недостатки: одноканальность, что вынуждает после каждого цикла промывать емкость и вносить в нее новый раствор следующего мономера.

Выход из ситуации: создание четырехканального диспенсера с четырьмя независимо перемещающимися размещающими элементами, каждый из которых соединен постоянно пополняющимся резервуаром соответствующего мономера. Такая схема позволяет производить синтез чипа непрерывно, не тратя времени на промывку и перезарядку диспенсера. Но на сегодняшний день, коммерчески доступный инструмент с подобными характеристиками (4-х канальный ink-jet принтер) отсутствует, хотя имеется патентная информация, посвященная этому способу синтеза чипов [5].

Параллельный подход. Он состоит не в селективном нанесении мономера на определенные участки, а в селективной активации (обычно депротекции) растущих концов полинуклеотидов. При использовании этого метода каждый новый нуклеотид обычно является защищенным по растущему концу. Так, что к нему не может быть присоединен последующий нуклеотид. На определенных участках чипа олигонуклеотиды подвергаются активации (депротекции), заключающейся в удалении защитной группы, или активации другим способом. После этого такие полинуклеотиды способны присоединить нуклеотиды, находящиеся в растворе. Следовательно, нет необходимости доставлять соответствующие мономеры к каждому участку чипа. Пространственная структура активных растущих концов создается в результате селективной активации (депротекции) соответствующих участков чипа.

Различные технологии синтеза с помощью данного подхода отличаются по способу депротекции или, в более широком смысле - активации. Наиболее распространенным и единственным практически реализованным на сегодняшний день является применение для селективной депротекции фотолитографических методов. Существуют два основных направления использования фотолитографии для синтеза ДНК-чипов:

1) Процес фотодепротекции на  избранных участках и применением  нуклеотидов с фотолабильными  защитными группами. Сущность этого  метода состоит в селективной  депротекции 5'-OH группы в участках  подвергаемых воздействию УФ  излучения. Набор этих участков  определяются при помощи создания  отверстий расположенных в соответствующем  порядке на фотолитографической  маске.  

Ультрафиолетовое излучение, проникающее через отверстие в маске, вызывает удаление фоточувствительной защитной группы с 5'-OH группы растущих олигонуклеотидных цепей расположенных на участке чипа прилежащих к отверстию. Образовавшиеся свободные 5'-OH группы на участках, подвергнутых ультрафиолетовому излучению, реагируют с 3' активированными фосфорамидитными группами добавляемых нуклеотидов с образованием фосфодиэфирной связи. При этом на 5'-OH этих нуклеотидов также имеются фотолабильные защитные группы, происходит добавление одного определенного олигонуклеотида к олигонуклеотидам, расположенных в требуемых позициях. Для добавления одного нуклеотида ко всем олигонуклеотидам требуются 4 цикла. А для синтеза олигонуклеотидов требуемой длины требуется 4 x n циклов, где n - длина олигонуклеотида.

Получаемая плотность олигонуклеотидов составляет около 1 млн на 1 см2, что соответствует размеру ячейки в 5-10 мкм. Разрешающая способность этого метода ограничена необходимостью создания высокого (1:100) контраста между облучаемыми и не облучаемыми участками, который не достижим при размерах ячейки менее 5 мкм вследствие дифракции УФ лучей на краях маски. Кроме того, использование фотолабильных защитных групп ограничивает возможность использования модифицированных олигонуклеотидов и однозначно определяет направление синтеза в направлении 3' R 5', что существенно затрудняет или делает невозможным ряд манипуляций с ДНК-пробами, имеющих важное значение (рис. 2.1).

Рис.2.1. Процесс фотодепротекции [4]

а - наращивание нуклеотидов; b - освещение определенных кластеров 

Но несмотря на указанные ограничения разработки в этой области продолжаются. Они состоят главным образом в разработке новых фотолабильных групп, которые обладали бы свойствами более полного удаления и возможностью использования их для защиты 3'-OH группы, т. е. обеспечения синтеза в 5' R 3' направлении.