Биологический микрочип. ДНК-микрочипы

2) Перспективным представляются  непрямые методы фотолитографии. При этом фоточувствительным является не сам синтезируемый субстрат, который в случае синтеза ДНК-чипа представлен фотолабильными защитными группами, а различные фотореактивные химические системы, специально созданные для этого. В этом случае пространственное разграничение облучённых и необлучённых участков обеспечивается изменением свойств этих систем, возникающим вследствие облучения. Далее эти различия в свойствах облучённого и необлучённого промежуточного субстрата различными методами трансформируется в пространственную организацию участков депротекции растущего конца олигонуклеотидов.

Подобный подход имеет два наиболее значимых преимущества.  

Первое из них состоит в возможности создавать фотореактивную систему с заданными желательными свойствами, независимо от ограничений накладываемых химической, в том числе пространственной структурой нуклеотидов и совместимости фотореакционных процессов с химией нуклеотидного синтеза. Поэтому такие критически важные параметры фоторецептивной системы как чувствительность, скорость процесса, уровень контраста и зависимость фотохимического эффекта от полученной дозы облучения легко поддаются оптимизации. Другим важным преимуществом является независимость процесса синтеза олигонуклеотидов от фотореакций и отсутствие связанных с этим требований и ограничений. Следовательно, для синтеза олигонуклеотидов в этом случае можно использовать самый эффективный на сегодняшний день, хорошо освоенный и оптимизированный фосфорамидитный метод, обеспечивающий стабильно высокую эффективность синтеза и позволяющий производить его в том числе и в 5' -> 3' направлении.

Главное отличие этой технологии состоит в отсутствии необходимости использования фотолабильных защитных групп и возможности более высокого разрешения за счет снижения требуемого уровня контрастности до 1:20 вследствие нелинейной зависимости реакций фоторезистивного материала от полученной дозы УФ облучения. Процесс происходит следующим образом: на поверхность чипа, с находящимися на нем 5' диметокситритил защищенными олигонуклеотидами, наносится слой полимера (полиимид) в растворителе (анизол) и высушивается, в результате чего образуется полимерная пленка, защищающая олигонуклеотиды от последующего воздействия. Далее на поверхность чипа наносится слой фоторезистивного полимера.

Чип облучается УФ излучением через литографическую маску. При этом облучение занимает всего 1,5 мин, что в 3 раза меньше, чем при использовании фотолабильных защитных групп. Чип промывается растворителем, удаляющим слой фоторезистивного покрытия только в участках подвергшихся облучению. Следующим этапом удаляется защищающий олигонуклеотиды слой полимера. Затем в кислотном растворе происходит снятие защитных групп. К свободным 5'-OH группам присоединяется следующий нуклеотид. Oба слоя полимера удаляются.

Метод позволяет достичь более высокой разрешающей способности. Продемонстрировано его применение для синтеза ячеек размером 10 мкм. Разрешающая способность ограничивается невозможностью удаления защитного слоя полимера вблизи краев ячейки толщиной около 1 мкм, что ограничивает дальнейшее сокращения размера ячеек менее 5 мкм. Указывается, что дальнейшая оптимизация метода позволит создавать ячейки размером около 1 мкм, что соответствует плотности около 100 млн на 1 см2 [5].

Одна из крупнейших фирм по производству биочипов — Affymetrix — изготовляет биочипы таким же способом, каким изготовляют электронные чипы (и расположена эта фирма в Силиконовой долине, в Калифорнии). Чипы Affymetrix наращиваются прямо из стеклянной пластинки методом фотолитографии с использованием специальных микромасок. На одном таком чипе расположены десятки (а иногда и сотни) тысяч пятен размером в несколько микрон (рис2.2.). Каждое пятно — это один уникальный фрагмент ДНК длиной в десятки нуклеотидов.

Рис. 2.2. Биочип компании Affymetrix

Изготовленный таким образом биочип в дальнейшем гибридизуют с молекулами ДНК, мечеными красителем. Сравнивают, например, ДНК, выделенную из здоровых клеток, и ДНК, выделенную из раковых клеток. Часто сравнивают ДНК, выделенную из разных больных. После гибридизации на биочипе возникают причудливые узоры. Эти узоры бывают разными у нормальных и у раковых клеток или сильно различаются при различных видах лейкозов. Излечимые виды лейкозов дают одни узоры (паттерны), неизлечимые дают совсем другие паттерны. На рис. 2.3 можно видеть, как окрашенная ДНК от разных больных образует различные паттерны на биочипе. Болезнь одна и таже, паттерны — разные. По виду паттернов можно с большой вероятностью предсказать течение болезни на самой ранней ее стадии. В данном случае при паттерне типа 1 верятность метастаз равна нулю, при паттерне типа 2 — уже 29%, при паттернах типа 3 и 4 соответственно 75% и 77% [4].

Рис 2.3. Изображение паттернов на биочипе [4]

Микрочипы Affymetrix обычно используют от 11 до 20 пар проб на каждый изучаемый ген. Одна компонента таких пар, называемая perfect match probe (PM), в точности комплементарна последовательности соответствующего гена - подразумевается, что именно его РНК будет присоединяться к PM-зонду. Такое присоединение называется специфической гибридизацией. Тем не менее, к зондам могут присоединяться нуклеотидные последовательности и других генов (неспецифическая гибридизация). Для оценки воздействия неспецифической гибридизации используется другие компоненты пары - зонды, называемые mismatch probe (MM). Последовательность нуклеотидов в них совпадает с последовательностью в соответствующих PM-пробах с заменой центрального (тринадцатого) нуклеотида на комплементарный. Соотношение интенсивности свечения PM- и MM-проб изначально использовалось для нейтрализации эффекта неспецифической гибридизации, однако более поздние исследования поставили под сомнение правильность подобного подхода [7].

Но в скором будущем фотолитографические технологии в утратят своё значение для синтеза чипов. Поэтому мы обращаем особое внимание на альтернативные технологии in situ синтеза ДНК-чипов, некоторые из которых появляются уже сейчас. И несомненно, что будущее индивидуальной геномики будет базироваться именно на этих технологиях. В сфере которых авторы сайта ведут свои перспективные разработки.

Среди этих технологий наиболее традиционной и близкой к фотолитографии является синтез олигонуклеидов в жидкой фазе фосфорамидитным методом с использованием фотогенерируемой кислотной депротекции. При этом в обычную систему для фосфорамидитного синтеза на стадии депротекции вводится фотоактивируемый предшественник из упомянутых выше, который при облучении служит источником протонов, вызывающих депротекцию DMT защищённых нуклеотидов. Соответственно, для обеспечения параллелизма реакция должна производиться в минимальном объёме жидкости и реакционный блок должен состоять из максимального количества реакционных сосудов. На ранней стадии разработки применялся модифицированный стандартный синтезатор для демонстрации осуществимости технологии.  

Итак, в ближайшее время следует ожидать большого прогресса в этой наиболее перспективной области синтеза ДНК-чипов [5].

2.2.Технология синтезу non in situ

Все эти методы основаны на размещении на поверхности чипа предварительно синтезированных одно-цепочечных ДНК, главным образом к-ДНК или олигонуклеотидов.

Исторически первыми были чипы с размещёнными на них олигонуклеотидами. Так как сама идея создания чипов состояла в использовании олигонуклеотидов [5].

Олигонуклеотиды (относительно короткие фрагменты однонитевой ДНК) синтезируют отдельно, а затем уже пришивают к стекляной подложке [4], обработанной различными аминоалкилтриалкоксисиланами, например APTES (3-аминопропилтриэтоксисилан для получения модифицированной поверхности. Такая поверхность является гидрофобной и позволяет наносить зонды с максимальной плотностью [1].

 Преимущества чипов с олигонуклеотидами  состоят в возможности проведения  мутационного анализа, исследований  полиморфизма, раздельном изучении  экспрессии высокогомологичных  генов.

Главным недостатком является необходимость предварительного синтеза большого количества олигонуклеотидов [5].

Чипы такого типа изготавливают в разных фирмах, в частности, в Москве, в Институте молекулярной биологии. Биочипы, изготовленные в ИМБ, позволяют различать у больных туберкулезом штаммы, отличные от штаммов устойчивых к антибиотикам. Проблема состоит в том, что у некоторых больных бактерии туберкулеза имеют устойчивость к антибиотику рифампицину и антибиотик не помогает при лечении болезни. У большей части больных бактерии обычные (т.н. дикие штаммы бактерий) и антибиотик помогает. Необходимо знать устойчивость бактерий к антибиотику в самом начале лечения. Если врачи определят устойчивость бактерий через 2–3 месяца после начала лечения, то легкие больного будут уже изрядно повреждены. Традиционные методы определения устойчивости бактерий туберкулеза могут отнять несколько недель. Биочипы позволяют решить эту задачу за 1–2 дня. На рис. 2.4 видны различные узоры паттерны гибридизации на российском биочипе двух штаммов туберкулеза: дикого и устойчивого к рифампицину.

На рисунке представлены гибридизационные картины (A, B) и соответствующие им диаграммы интенсивности флуоресцентных сигналов (C, D). A и C — прогибридизована последовательность дикого типа, B и D — последовательность содержит мутацию, приводящую к замене His526>Tyr (показана стрелкой) [4].

Рис. 2.4. Различные узоры паттерны гибридизации [4]

Другим распространённым типом чипов являются так называемые "к-ДНК-чипы". Это чипы, на поверхность которых нанесены одно-цепочечные молекулы ДНК. Обычно это ДНК, полученная из продуктов PCR. Процесс синтеза таких чипов сложный и длительный.

Главным преимуществом "к-ДНК-чипов" по сравнению с олигонуклеотидными является возможность синтеза иммобилизированной на них ДНК методом PCR с использованием праймеров одной и той же последовательности для любого числа клонов. Вследствие этого, количество получаемой ДНК практически неограниченно. Современные термоциклеры способны производить амплификацию одновременно в нескольких планшетах на 96 или 384 лунки.

Существует технология получения ДНК-чипов на основе кремния с наноканалами диаметром 10-20 нм и длиной несколько сот нм. Он наносится на подложку, к которой прикреплены однонитевые специфические фрагменты ДНК, служащие мишенью для комплементарных молекул исследуемого материала. Жидкость с исследуемым материалом пропускают через наноканалы, и в случае комплементарного соответствия ДНК в исследуемом материале и ДНК подложки канал закупоривается. При этом регистрируются изменения электрической проводимости, и делается вывод о наличии специфического взаимодействия.

Принципиально новая технология анализа ДНК- и РНК-микрочипов разработана в Национальной лаборатории Министерства энергетики США под руководством профессора химии Джея Грувса. Она основана на измерении сил электростатического отталкивания, возникающего между объектами, обладающими зарядами одинакового знака. По этой методике на поверхность микрочипа наносится жидкость, которая содержит мельчайшие электрически заряженные кремниевые сферы. Затем анализируют броуновское движение этих сфер по поверхности микрочипа и измеряют силы электрического отталкивания между заряженными сферами и молекулами ДНК (РНК), связавшимися с пробой на микрочипе. Измерение сигнала электростатического взаимодействия позволяет одновременно анализировать миллионы последовательностей ДНК, наблюдать за ходом анализа в реальном времени, а также записывать получаемые результаты на видеокамеру. Методика позволяет получить быстрый и качественный результат и обладает хорошей чувствительностью.

Российская компания «Биочип-ИМБ» выпускает стеклянные биочипы с ячейками, заполненными гелем. Гель прикреплен к поверхности матрицы (стеклянной, пластиковой или силиконовой) химической связью. В объеме геля равномерно распределяются и закрепляются химическими связями различные биологические молекулы. Иммобилизация в трехмерном объеме дает ряд существенных преимуществ. В десятки и сотни раз увеличивается емкость биочипа на единицу поверхности и, соответственно увеличивается его чувствительность.

Гель - гомогенная среда, состоящая на 95% из воды, поэтому закрепленные в нем макромолекулы не взаимодействуют ни друг с другом, ни с платформой чипа. Это особенно существенно для белковых чипов, поскольку белки имеют тенденцию к денатурации в месте соприкосновения твердой поверхности чипа и водной средой.

В ряде лабораторий началась разработка генетических микрочипов для проведения фармакогенетических тестов при экспертизе новых лекарственных средств. Это чипы, с помощью которых можно будет выявлять в генах пациента или лабораторного животного мутантные аллели, ответственные за фармакологический эффект того ли иного препарата. Уже выпускаются биочипы с генетическим материалом мышей для лабораторных исследований. Мышь - наиболее изученный и часто используемый модельный организм для фундаментальных исследований клеточных и молекулярных процессов в фармакологии и биотехнологии. На таких биочипах представлены около 10000 генов мыши. Функции практически всех генов биочипа известны или, как минимум, определен кодируемый ими белок [7].

Теперь приведем пример новейших специальных разработок в области биочипов. Специалисты из Нортвестернского университета в США разработали для американской армии биочип, обладающий совершенно неожиданными свойствами. Если на этот биочип попадает ДНК от патогенных микробов, то фрагменты ДНК зондов с прикрепленными к ним микроскопическими частицами золота выстраиваются в ряд. Между электродами идет ток и биочип сигнализирует об угрозе. Схема такого биочипа приведена на рис. 2.5. Специальный биочип сигнализирует о наличии бактериальной угрозы после того, как золотые микрочастицы замыкают два электрода [4].

Рис. 2.5. Схема микрочипа для детекции патогенов

3. ДЕТЕКЦИЯ  РЕЗУЛЬТАТОВ ГИБРИДИЗАЦИИ

Детекция результатов гибридизации состоит в определении тех ячеек чипа, где произошла гибридизация иммобилизованной на поверхности чипа ДНК пробы и анализируемой ДНК последовательности. Поскольку каждая ячейка чипа содержит ДНК пробу одной определенной последовательности, то её гибридизация с анализируемой ДНК однозначно указывает на наличие в составе анализируемой ДНК последовательности комплементарной последовательности ДНК пробы, расположенной в этой ячейке. Фактически, определение ячеек чипа, в которых произошла гибридизация иммобилизированных в ней ДНК проб с анализируемой ДНК последовательностью заключается в определении наличия в ячейке анализируемой ДНК. Очевидно, что для ее определения анализируемая ДНК должна быть меченой. Именно в типе используемой метки и заключается различие методов, используемых для детекции результатов [5].