Биологический микрочип. ДНК-микрочипы

3.1. Радиоизотопная детекция

Исторически первым было использование радиоактивной метки, начавшееся ещё со времен первых гибридизационных экспериментов в 50-60-х годах и сохранившееся до настоящего времени. Преимущество радиоизотопного метода: высокая чувствительность, связанная с уникальной возможностью "накопления эффекта", без использования какой-либо техники - на обычной фотобумаге.

Для мечения анализируемой ДНК обычно используется нуклеотиды, содержащие радиоактивный фосфатный остаток (обычно р33), вводимые в цепь ДНК при её синтезе. При этом каждая молекула ДНК содержит несколько атомов радиоактивного фосфора, количество которых максимально может быть равно количеству нуклеотидов. Наличие нескольких меток в составе исследуемой ДНК повышает чувствительность реакции. Особенно важно, что фосфор является естественным компонентом ДНК, следовательно, наличие метки не влияет на гибридизацию.

Недостатки: невозможна детекция чипов с плотностью больше 1000 ячеек на 1 см2 поскольку в качестве детектора используется фотопленка, возможности которой и лимитируют использование этого метода; сложен количественный анализ в связи с невозможностью проведения прямого сравнения сигналов изучаемого и тест субстрата, поскольку одновременное исследование двух различных субстратов невозможно, а плохая воспроизводимость вследствие аналогового характера детектора затрудняет сравнение сигналов контрольного и исследуемого субстрата [5].

3.2. Флуоресцентная детекция

В качестве генератора флуоресцентного сигнала могут использоваться красители, непосредственно присоединённые к изучаемой последовательности, например, введение в её состав с помощью флуоресцентно меченных праймеров. Но чаще используется непрямой метод, при котором последовательность содержит биотин, к которому присоединяются красители, соединённые со стрептавидином. Большим достижением в этой области стала разработка специальных флуоресцентных комплексов, содержащих более 1 000 флуоресцентных молекул каждый. Это пропорционально увеличивает интенсивность сигнала, а, следовательно, и чувствительность метода.

Для проведения сравнительного анализа обычно используется двухцветная детекция при которой анализируемая ДНК и тест-ДНК метятся разными красителями. Одновременная детекция обоих сигналов в каждой из ячеек позволяет прямо сравнить их интенсивность и избежать ошибок, связанных с неполной воспроизводимостью результатов. Метод используется как для повышения точности мутационного анализа выполняемого с помощью олигонуклеотидных чипов, синтезированных способом фотолитографии, при котором в качестве тест субстрата используются немутантная последовательность, с которой сравнивается исследуемая. Так и для проведения анализа экспрессии генов с использованием чипов с иммобилизованной на них ДНК полученной методом PCR, поскольку для этого типа чипов возможен только сравнительный анализ экспрессии, то разными красителями метятся наборы к-ДНК картину экспрессии которых и нужно сравнить [5].

На рис. 3.1 показан принцип действия ячейки ДНК или олигонуклеотидного биочипа, основанный на комплементарных взаимодействиях основания аденина (А) с тимином (Т) и гуанина (G) с цитозином (С) в двух нитях ДНК. Если последовательность оснований в одной нити ДНК (или олигонуклеотида) полностью комплементарна последовательности другой нити, то образуется стабильная совершенная двухнитчатая спираль - дуплекс. Однако присутствие в дуплексе даже одной неправильной пары, например G-G, предотвращает образование дуплекса. Если иммобилизовать в одном из элементов микрочипа специфическую одноцепочечную ДНК или, положим, 20-мерный олигонуклеотид (пробу), то при добавлении к микрочипу меченных флюоресцентными красителями фрагментов ДНК, например генома человека, будет происходить их высокоспецифичное взаимодействие. Заданный олигонуклеотидный элемент биочипа специфически свяжет только одну комплементарную последовательность из 420 = 1.09 х 1012 всех возможных последовательностей этой длины в ДНК. В результате флюоресцентное свечение наблюдается только на этом комплементарном элементе биочипа. Таким образом, один элемент биочипа производит одну выборку примерно из триллиона возможных вариантов, в отличие от элемента электронного чипа, где происходит двоичная выборка: ДА или НЕТ.

Рис. 3.1. Принцип флуоресцентной детекции [2]

Олигонуклеотид фиксирован на одном из элементов биочипа и избирательно связывает из многих флуоресцентно меченых фрагментов ДНК только комплементарный. В результате только этот элемент начинает светиться. Это происходит благодаря высоко-специфичным взаимодействиям комплементарных пар нуклеотидов А с Т и G с С. Присутствие некомплементарной пары, например G-G, предотвращает взаимодействие и оставляет элемент микрочипа темным [2].

Преимущества: высокая скорость анализа; возможность детекции флуоресцентного сигнала в чрезвычайно широком диапазоне длин волн, что определяется простым подбором соответствующих светофильтров.

Недостатки:

• разрешающая способность, которая на сегодняшний день составляет около 30 мкм. Это делает эту технологию неприменимой для анализа чипов синтезированных с помощью фотолитографических методов, где требуется разрешение менее 3 мкм.
• высокий уровень побочной флуоресценции, то есть невозможность дифференцировать флуоресценцию гибридизировавшейся пробы от негибридизировавшейся находящейся в растворе. Это требует тщательной промывки чипа для удаления негибридизировавшейся пробы, что может снизить интенсивность гибридизационного сигнала и требует времени, что неприемлемо для динамического мутационного анализа.

 Другим  направлением, получившим большее  распространение, является сканирующая  конфокальная лазерная микроскопия. При этом источником света  является лазер с длиной волны  соответствующей пику поглощения  флурохрома. Детекция осуществляется  с использованием конфокального  сканирующего микроскопа. Объектив  такого микроскопа оснащен узкопросветным  коллиматором, который ограничивает  воздействие побочной флуоресценции. Изображение при помощи оптической  системы микроскопа фокусируется  на ПЗС матрице. Объектив движется  над поверхностью чипа, обеспечивая  его просмотр.

Преимущества: высокая разрешающая способность, делающая его единственным методом для детекции результатов гибридизации на чипах синтезированных методом фотолитографии. При этом время "чтения" такого чипа составляет менее 3-х минут. Другое преимущество состоит в отсутствии побочного флуоресцентного сигнала вследствие ограничения площади детекции. Это позволяет селективно определять флуоресценцию гибридировавшейся пробы и исключить влияние негибридизировавшейся пробы находящейся в растворе.

Недостатки: относительно низкая скорость детекции и невозможность одновременного анализа всего чипа, что делает эту технологию неприменимой для динамического мутационного анализа. Существуют и ругие оптические методі детекции [5].

3.3. Спектроскопические методы

Масспектроскопия. Метод основан на измерении соотношения масса/заряд ионов. Эти ионы образуются вследствие ионизации исследуемого субстрата различными способами. Для анализа полинуклеотидов обычно используется метод, получивший название матриксоопосредованная лазерная десорбция/ионизация.

Сущность метода состоит в том, что нуклеотиды помещаются в кристаллический матрикс, имеющий максимум поглощения, соответствующий длине волны лазера. Ионизация происходит под воздействием короткого лазерного импульса. Детекция результатов обычно производится путём измерения времени требующегося ионизированным нуклеотидам для достижения детектора при движении в сильном магнитном поле. Это время - время полёта (time of flight - TOF) пропорционально квадратному корню соотношения заряд/масса. Современные приборы позволяют измерить это соотношение с точностью более 0,1 % (1/1 000). То есть могут быть обнаружены различия на одну единицу массы для соединений с массой 1 000.

Для полинуклеотидов минимальное различие в массе возникает при А"Т трансверсии и составляет 9. Это позволяет определять мутации в олигонуклеотидах длинной около 30 оснований. Время каждого анализа составляет около 1 секунды. Таким образом, масс спектроскопия предоставляет уникальную возможность мутационного анализа на чипах без использования динамического мутационного анализа и не предъявляет высочайших требований к специфичности гибридизации для мутационного анализа при помощи техники предпочтительной гибридизации. Применение этого подхода с анализом самой гибридизировавшейся пробы позволяет отказаться от ее мечения каким-либо способом. Но этот способ имеет довольно низкую чувствительность и требует наличие банка данных для сравнения результатов измерения с эталоном (немутантной последовательностью), а воспроизводимость результатов может быть недостаточной из-за подверженности влиянию случайных факторов. Метод предложен и разрабатывается фирмой Sequenom [5].

3.4. Электрохимические методы

Методы основаны на изменении электрохимического потенциала электрода, на поверхности которого иммобилизированы ДНК пробы при гибридизации с ними исследуемой ДНК. Первый подход основан на мечении исследуемых молекул комплексами, содержащими атомы железа. Наличие этих проб на поверхности электрода изменяет его электрохимический потенциал. Метод разработан компанией Clinical Micro Sensors.

Второй состоит в детекции интенсивности окислительно-восстановительного потенциала, возникающего при окислении гуаниновых оснований. При этом исследуемая последовательность не нуждается в мечении. Детекция гибридизации основана на резком снижении уровня окисления гуаниновых оснований на аноде при формировании двухцепочной структуры.

Итак, электрохимические методы детекции гибридизации являются самыми перспективным на сегодняшний день направлением развития этих технологий. Поскольку они позволяют использовать накопленный технологический потенциал в области электрохимии и микроэлектроники. Разрешающая способность этих методов зависит от возможного количества электродов. Технологии, разработанные для создания микроэлектронных устройств, позволяют сделать плотность этих электродов очень высокой. Использование электрохимических процессов позволяет проводить на одном чипе в одном реакционном объёме сразу все этапы анализа: иммобилизацию пробы, гибридизацию, детекцию. Электрохимические способы детекции позволяют осуществлять динамический мутационный анализ, поскольку способны одновременно количественно определять уровень гибридизационного сигнала на всей поверхности чипа с очень высокой скоростью.

Пока все исследования в области электрохимических методов детекции находятся на стадии первых модельных экспериментов и ещё рано говорить о появлении технологий, которые могли бы быть использованы для практических целей [5].

4. ПРИМИНЕНИЕ  БИОЧИПОВ

Биочипы используются для самых разных целей. Биочипы применяются для обнаружения бактериальных и вирусных контаминаций в продуктах питания, косметике и окружающей среде, выявления генно-модифицированных организмов в пищевых продуктах, диагностики и прогнозирования различных заболеваний, детекции особо опасных инфекционных агентов в анти-биотеррористических целях и другие [1].

Армия США утверждает, что обладает биочипами, позволяющими очень быстро определять наличие в окружающей среде болезнетворных микробов.

В медицине биочипы помогают за считанные часы обнаруживать у больных лекарственно устойчивые формы туберкулеза. Еще одно очень важное медицинское применение биочипов — это диагностика лейкозов и других раковых заболеваний. Биочипы позволяют быстро, за считанные дни или даже часы различать внешне неразличимые виды лейкозов. При одних лейкозах пациента можно быстро и эффективно вылечить современными лекарствами. При других — не стоит даже пробовать, надо сразу делать пересадку костного мозга. Врачи не могут быстро отличить эти лейкозы друг от друга, а стратегию лечения надо правильно выбирать с самого начала. Также биочипы позволяют сразу отличить две формы рака груди — легко излечимую и плохо излечимую. Биочипы применяются и для диагностики других видов рака.

Исследователи в университетах и в фармакологических фирмах проводят на чипах одновременный анализ работы тысяч и десятков тысяч генов и сравнивают экспрессию этих генов в здоровых и в раковых клетках. Такие исследования помогают создавать новые лекарственные препараты и быстро выяснять, на какие гены и каким образом эти новые лекарства действуют. Биочипы являются также незаменимым инструментом для биологов, которые могут сразу, за один эксперимент, увидеть влияние различных факторов (лекарств, белков, питания) на работу десятков тысяч генов [4]

Микрочип, способный захватывать раковые клетки подобно медузе

Медленные гипнотические движения медуз вдохновили ученых на создание некоторых вещей, от искусственной медузы, которая функционирует за счет живых клеток тканей сердечной мышцы, и до медуз-роботов, способных к выполнению некоторых действий. А не так давно ученые, используя некоторые элементы строения тела медузы, создали микрочип, который способен захватывать и удерживать раковые клетки и другие посторонние клетки, находящиеся в крови человека.

Медузы захватывают частицы еды, плавающие в воде, с помощью своих длинных щупалец, на концах которых находятся липкие элементы. Исследователи из медицинского учреждения Brigham and Women's Hospital в Бостоне использовали точно такой же принцип в создании микрожидкостного чипа, который имеет повторяющиеся цепочки длинных ДНК, выполняющих функции щупалец медузы. Эти цепочки ДНК настроены таким образом, что они скрепляются с определенными видами белков, присутствующих на поверхности раковых клеток, плавающих в крови.

Извлечение раковых клеток, находящихся в крови человека, может предоставить медикам ключевую информацию о развитии раковой опухоли и о влиянии на нее лекарственных препаратов. Это устройство, чип-медуза, может использоваться не только в диагностике раковых заболеваний. Цепочки ДНК могут быть настроены таким образом, что с их помощью можно будет захватывать и другие чужеродные клетки, находящиеся в крови, такие как посторонние эмбриональные клетки, вирусы, бактерии и другие микроорганизмы.

Другие микрожидкостные диагностические устройства в своей работе полагаются на свойства антител и специально спроектированные нуклеиновые кислоты. Но такие устройства не в состоянии захватить и удержать чужеродные объекты больших размеров, такие как многоклеточные организмы. Новое устройство-медуза успешно справляется с этим, а ключевым моментом является расположение цепочек ДНК в этом чипе "елочкой" (рис.4.1). Такая конфигурация липких "щупалец медузы" позволяет чипу не только захватывать раковые клетки, но и при определенном внешнем воздействии выпускать собранный материал для того, что бы его можно было изучить в лабораторных условиях.