Биотестирование окружающей среды

 

4.2 Биотестирование загрязнения воды с помощью ряски малой

 

Представители семейства рясковых являются самыми маленькими цветковыми растениями в мире. В результате гидрофильной эволюции они достигли крайней степени редукции всех органов, поэтому по простоте строения занимают первое место среди цветковых растений. Это – водные, свободно плавающие, многолетние травянистые растения.

Вегетативное тело рясковых называется листецом. Листецы одиночные или собраны в небольшие группы с помощью гиалиновой нити – тонкого выроста мембраны. Листецы состоят из паренхимных клеток хлоренхимы, разделенных большими межклеточными полостями, заполненными воздухом. Проводящая система неразвита. Корни развиты слабо и не достают грунта, по строению простые, одинарные (у многокоренника их число составляет от 3 до 10), отходят от брюшной поверхности листеца, зеленые, поскольку содержат хлорофилл. Рясковые – растения космополиты, распространены по всему свету. Вегетативное тело по виду напоминает крошечный плавающий лист или слоевище низших растений, поэтому длительное время их считали водорослями.

Листецы рясковых либо одиночные, либо соединены в небольшие группы. Форма листецов может быть почковидной или шаровидной. Цветение у рясок наблюдается крайне редко. Плоды хорошо видны невооруженным глазом, они чуть больше макового зернышка.

Ряску называют «экологической дрозофилой». Особенности морфологического строения, высокая скорость размножения, чувствительность к среде обитания – все это сделало ряску удобным – объектом для биологического тестирования. Семейство рясковых содержит более 40 видов, из них в России обитает только 5 видов (Lemna minor L., L. trisuica L., L. gibba L., Spirodela polyrrhiza L., Wolffia arrhiza L.).

Ряска малая (Lemna minor L.) – растение, плавающее на воде. Размер листецов 2 – 4 мм. Число жилок 3. Листецы плоские, образуют группы из 3 – 6 растений. Встречается в стоячих водах. Корни длинные, но не достигают грунта, а выполняют главным образом функцию якоря, предотвращая переворачивание растений в воде. Встречается чаще всего в стоячих водах [24].

Рясковые размножаются преимущественно вегетативно, отдельный лист может пройти 10 делений за период 7 – 10 сут. Рясковые могут удваивать свою массу за время от 10 ч до 2 суток при оптимальных температуре, освещении и питании.

Острое токсическое действие исследуемой воды на ряску определяется по гибели ее за определенный период времени. Критерием острой токсичности служит гибель 50 % и более растений за 96 ч в исследуемой воде при условии, что в контроле погибло не менее 10 % растений.

В экспериментах по определению острого токсического действия устанавливают: среднюю летальную концентрацию отдельных веществ (кратность разбавления вод, содержащих смеси веществ), вызывающую гибель 50 % и более тест-организмов; безвредную (не вызывающую эффекта острой токсичности) концентрацию отдельных веществ (кратность разбавления вод, содержащих смеси веществ), вызывающую гибель не более 10 % тест-организмов.

Хроническое токсическое действие исследуемой воды на ряску малую оценивают по смертности и скорости роста за период до 24 сут в исследуемой воде по сравнению с контролем. Критерием хронической токсичности служит гибель 20 % и более тест-организмов и (или) достоверное отклонение в скорости роста из числа выживших растений по сравнению с контролем.

Биотестирование проводится в лабораторных условиях. Помещение не должно содержать токсичных паров и газов. Температура окружающего воздуха в лаборатории от + 18 до + 25 °С. Атмосферное давление 84 – 106 кПа (630 – 800 мм рт.ст.). Освещение помещения естественное или искусственное, не ограничено особыми требованиями. Освещенность для ряски 2 500 – 3 500 лк. Интенсивность света должна быть более чем на 15 % больше по сравнению с дневным светом.

Предварительная подготовка к отбору проб и выполнению биотестирования включает подготовку посуды, пробоотборников, мест хранения отобранных проб, а также подготовку рабочего места для обработки доставленных в лабораторию проб и исследования их на токсичность. Все процедуры предварительной подготовки должны исключить попадание токсичных, органических и каких- либо других веществ в исследуемую воду.

Посуда для отбора проб и биотестирования должна быть химически чистой. Она промывается смесью бихромата калия и серной кислоты (хромовой смесью).

Химически чистая посуда для биотестирования должна храниться с закрытыми стеклянными притертыми пробками или завинчивающимися крышками в защищенных от пыли ящиках лабораторного стола или на закрытых полках, стеллажах и т. п. Вся грязная посуда после проведения анализов должна подвергаться стерилизации кипячением в течение 1 ч.

Культивационная вода используется для разведения маточной культуры, в качестве контрольной с добавлением питательного раствора для биотестирования, для разбавления исследуемых вод.

В культивационной воде должны отсутствовать органические загрязняющие вещества, хлор, токсические вещества и антагонистические для ряски организмы (синезеленые водоросли, простейшие, многоклеточные); рН быть в пределах 4,5 – 7,0, температура (20 ± 5) °С [25].

Принцип метода основан на определении гибели и изменений в темпах роста ряски малой, учете морфологических изменений (хлороз, некроз поверхности листеца, расслоение листецов) при воздействии токсических веществ в исследуемой среде по сравнению с контролем.

В тестировании использовали 5-дневный цикл развития растений.

Результаты исследований учета роста тест-объекта заносятся в таблицу и делаются пометки, какие растения изменили цвет, фиксируется наличие или отсутствие корней и описывается общий вид растений. Проводится стандартная статистическая обработка и анализ полученных результатов. Первый шаг – проверка контрольного варианта с целью выявления фонового роста ряски в незагрязненных условиях. Если растения ряски в контрольном варианте не выросли или выглядят не совсем здоровыми, то результаты эксперимента аннулируются. Возможно, питательный раствор был слишком сильный или растения были не здоровы в самом начале эксперимента; также возможны проблемы с окружающей средой во время тестирования. Значение описания всевозможных изменений, происходящих с тест-объектом, очень важно.

Перечень основных терминов и понятий.

Колония – сообщество материнских и дочерних листецов, соединенных друг с другом.

Листец – одиночное растение в колонии рясок. Это маленькая пластинка, которая соединила в себе лист и стебель, способная к размножению.

Маточная культура – растения одного вида рясок.

Питательный раствор – раствор, содержащий питательные вещества и микроэлементы для роста ряски.

Посевная культура – число листецов, добавленных в тестируемую среду в начале биотестирования.

Предшествующая культура – культура рясок, используемая для акклиматизации тестируемых растений в условиях эксперимента.

Прирост – увеличение биомассы за определенный промежуток времени; оценивается подсчетом численности листецов.

Среда для культивирования – раствор питательных веществ в отстоянной водопроводной воде для обеспечения роста ряски, а также для разбавления исследуемых вод.

Тестируемый образец – получают из анализируемой природной воды, сточных вод и растворов загрязняющих веществ посредством различных приготовлений, таких как разбавление, фильтрация, нейтрализация.

Тестируемый раствор – это комбинация из тестируемого образца, дистиллированной воды и питательного раствора.

Хлороз листеца – пожелтение или полное обесцвечивание листеца в результате потери пигмента.

Чистая культура – культура растений ряски, свободная от других организмов (других видов рясок, водорослей или водных животных) [17].

 

4.3 Оценка токсичности  вод пресного водоема по фильтрационной  активности дафний

 

Дафнии – наиболее часто используемый тест-объект для определения токсичности воды. Метод позволяет определить токсичность сточных и природных вод. Критерием острой токсичности является гибель 50 % и более дафний в анализируемой воде по сравнению с контролем в течение 24, 48 или 96 ч.

Культура дафний. Исходный материал желательно приобрести в специальных учреждениях и организациях. В опытах можно использовать и свою культуру. Для этого из самого чистого в вашей местности водоема с помощью гидробиологического сачка отлавливают дафний и помещают в стеклянные емкости, которые заполняют под пробку водой из этого же водоема. Одновременно отбирают 5 – 10 л воды для последующей посадки дафний. Дафнии отделяют декантированием жидкости. Затем отобранную природную воду фильтруют через фильтр и заполняют ею подготовленные стеклянные сосуды емкостью 3 – 5 л примерно на одну треть объема, куда переносят дафний с помощью стеклянной трубки с внутренним диаметром 0,5 – 0,7 см с оплавленным концом. Начальная плотность посадки – 6 – 10 особей на 1 л воды. Спустя 5 – 7 суток, в течение которых дафнии привыкают к лабораторным условиям существования и начинают размножаться, в сосуды доливают воду для дальнейшего культивирования.

При поддержании культуры в помещении не должно быть вредных газов и токсичных паров. Оптимальная температура 20 ± 2 °С, продолжительность светового дня 12 – 14 ч (не освещать культуру прямыми солнечными лучами). Посуду для содержания дафний нельзя мыть моющими веществами и органическими растворителями, лучше мыть питьевой содой, при особом загрязнении – хромовой смесью или соляной кислотой. Для культивирования дафний используют водопроводную воду, предварительно отстоянную не менее 7 суток и насыщенную кислородом (рН = 7,0 – 8,2; жесткость общая – 3 – 4 мг-экв/л; концентрация растворенного кислорода не менее 6,0 мг/л). Раз в 7 – 10 суток половину объема воды с культурой дафний заменяют на свежую, удаляют скопившийся на дне осадок и при большой плотности (более 25 самок) культуру прореживают. Не следует производить аэрацию воды в сосудах.

Кормом для дафний служат зеленые водоросли (хлорелла) и хлебопекарные дрожжи. Для приготовления дрожжевого корма берут 1 г свежих или 0,3 г воздушно-сухих дрожжей, заливают их 100 мл дистиллированной воды. После набухания дрожжи тщательно перемешивают, дают отстояться в течение 30 мин. Надосадочную жидкость добавляют в сосуды с дафниями в количестве 3 мл на 1 л воды. Кормят дафний 1 – 2 раза в неделю. Для выращивания зеленых водорослей требуется сложная методика, поэтому при возможности приобретают их в одной из лабораторий и хранят в холодильнике (срок хранения 14 суток). Вносят 1 мл суспензии водорослей на 1 л воды [12].

При невозможности культивирования дафний можно допустить использование только что отловленных дафний.

Отбор пробы. Пробу природной (сточной) воды отбирают объемом до 1 л. До биотестирования возможно хранение ее не более 6 часов при температуре 4 °С. Далее пробу фильтруют через фильтровальную бумагу и заливают в емкости для биотестирования.

В каждый сосуд помещают по 10 особей дафний. Их переносят стеклянной трубкой диаметром 5 – 7 мм сначала в сачок, а затем в сосуды, погрузив его в воду. Наблюдают за ходом эксперимента через 24, 48 или 96 часов. Дафний во время эксперимента не кормят. По окончании эксперимента проводят учет выживших дафний. Выжившими считаются дафнии, если они свободно передвигаются в толще воды или всплывают со дна сосуда не позднее 15 с после его легкого покачивания.

Проведение подсчета. На основании полученных результатов в  3-х повторностях рассчитывают среднее арифметическое количество выживших дафний в контроле и опыте. Для расчета тест-параметра – процента гибели дафний в опыте по отношению к контролю – используют формулу:

 

 
                                                  (1),

 

где Х1 и Х2 – среднее арифметическое количество (экземпляров) выживших дафний в контроле и опыте.

 

Проба воды оценивается как обладающая острой токсичностью, если за 24 ч биотестирования в ней гибнет 50 % и более дафний по сравнению с контролем.

Если в течение опыта в контрольном варианте произошла гибель более 10 % дафний, то полученные результаты не учитывают, опыт повторяют, предварительно проверив пригодность тест-объекта для биотестирования.

При определении пригодности биообъекта для тестирования, а также для показа в демонстрационном эксперименте используют токсичное вещество – дихромат калия (K2Cr2O7). В разбавленных до 1 – 2,5 мг/л растворах гибель дафний должна приближаться к 50 %. Разбавленный раствор дихромата калия получают, добавляя 1 – 2,5 мл маточного раствора (1 г K2Cr2O7 в 1 л дистиллированной воды) к 1 л контрольной воды [17].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Заключение

 

В настоящий момент одной из задач в области охраны окружающей среды является разработка эффективных методов оценки антропогенного воздействия на гидросферу с целью ограничения её токсического загрязнения и обеспечения нормального функционирования водных систем.

Долгое время контроль загрязнения окружающей среды осуществлялся только физико-химическими методами. Сегодня много загрязняющих веществ по разным причинам не контролируется: для одних не разработаны ПДК, для других отсутствуют утвержденные методики определения. В результате широкий спектр соединений, токсичных веществ в водной среде не контролируются. Заполнить информационный аналитический вакуум о комбинационном воздействии загрязнителей призваны методы биотестирования и биоиндикации.

Широкое внедрение этих методов в практику оценки качества вод – настоятельная необходимость времени, так как никакая даже самая современная аналитическая химия не даст полной информации о токсичности среды. К тому же анализ существующих методов оценки качества природных вод показал, что биотестирование – наиболее точный, быстрый и дешёвый способ охраны природных вод

Особенность информации, получаемой с помощью методов биотестирования состоит в том, что она позволяет сделать вывод о совокупном воздействии загрязняющих веществ различной природы на живые организмы и выявить степень их опасности.

В отличие от биотестирования биоиндикация представляет собой выявление последствий загрязнения водного объекта по функциональным и морфологическим показателям его обитателей или по экологическим характеристикам сообщества. Изменения, зарегистрированные методами биоиндикации, являются результатом уже состоявшегося ранее загрязнения с заведомым превышением нормативов, или длительного загрязнения малой интенсивности. Ее результаты могут быть учтены при корректировке нормативов, при выборе зоны применения биотестирования или при определении природоохранной стратегии.