Биотехнологические разработки

 

Одноклеточные организмы характеризуются высоким содержанием белка — от 40 до 80% и более. Белок одноклеточных богат лизином, незаменимой аминокислотой, определяющей его кормовую ценность. Добавка биомассы одноклеточных к недостаточным по лизину растительным кормам позволяет приблизить их аминокислотный состав к оптимальному. Недостатком биомассы одноклеточных является нехватка серусодержащих аминокислот, в первую очередь метионина. У одноклеточных его приблизительно вдвое меньше, чем в рыбной муке. Этот недостаток присущ и таким традиционным белковым кормам, как соевая мука. Питательная ценность биомассы одноклеточных может быть значительно повышена добавкой синтетического метионина.

 

Производство кормового белка на основе одноклеточных — процесс, не требующий посевных площадей, не зависящий от климатических и погодных условий. Он может быть осуществлен в непрерывном и автоматизированном режиме.

 

В нашей стране производится биомасса одноклеточных, в особенности на базе углеводородного сырья. Достигнутые успехи не должны заслонять проблемы, возникающей при использовании углеводородов как субстратов для крупномасштабного производства белка, — ограниченность их ресурсов. Важнейшими альтернативными субстратами служит метанол, этанол, углеводы растительного происхождения, в перспективе водород.

 

Очищенный этанол на мировом рынке стоит почти вдвое дороже метанола, но этанол отличается очень высокой эффективностью биоконверсии. Из 1 кг этанола можно получить до 880 г дрожжевой массы, а из 1 кг метанола-до 440 г. Биомасса из этанола особенно богата лизином — до 7%.

 

Большое значение для животноводства имеет обогащение растительных кормов микробным белком. Для этого широко применяют твердофазные процессы.

 

Перспективными источниками белка представляются фото-трофные микроорганизмы, в особенности цианобактерии рода Spirulina и зеленые одноклеточные водоросли из родовChlorella и Scenedesmus. Наряду с обычными аппаратами для их выращивания используют искусственные водоемы. Добавление к растительным кормам биомассы Scenedesmusпозволяет резко повысить эффективность усвоения белков животными.

 

Таким образом, существуют разнообразные источники сырья для получения биомассы одноклеточных. Некоторые субстраты (этанол) дают столь высококачественный белок, что он может быть рекомендован в пищу. Цианобактерии рода Spirulina издавна используют в пищу ацтеки в Центральной Америке и племена, обитающие на озере Чад в Африке.

 

3 ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ БИОЭНЕРГЕТИКА

 

Технологическая биоэнергетика — одно из направлений биотехнологии, связанное с эффективным использованием энергии, запасаемой при фотосинтезе. Это может быть достигнуто путем: 1) превращения биомассы, накопленной в результате фотосинтеза в дешевое и высококалорийное топливо — метан и другие углеводороды, этанол и т. д.; 2) модификации самого процесса фотосинтеза, в результате которой энергия света с максимальной эффективностью используется на образование водорода или другого топлива, минуя стадию фотоассимиляции СО2 и синтеза компонентов клетки. На уровне теоретических разработок находится идея непосредственного преобразования энергии Солнца в электрическую (биофотоэлектрические преобразователи энергии).

 

Рассмотрим вначале путь, пролегающий через использование биомассы, в первую очередь, растительной, ресурсы которой в мире огромны и оцениваются в 100 млрд. т по сухому веществу в год. Лишь незначительная часть ее расходуется человечеством, но и эта часть дает до 14% потребляемой в мире энергии. Биомасса — не только возобновляемый и почти даровой источник энергии, но и альтернатива тающим запасам полезных ископаемых.

 

Получение этанола как топлива.

 

Этанол — экологически чистое топливо, дающее при сгорании СО2 и Н2О. Он используется в двигателях внутреннего сгорания в чистом виде или как 10—20%-ная добавка к бензину (газохол). В Бразилии уже к 1983 г. 75% автомобилей работали на 95%-ном этаноле, а остальные — на газохоле. В США предполагают заменить на этанол 10% потребляемого бензина. Широкое внедрение этанола планируется в странах Западной Европы.

 

На значительных посевных площадях намечают выращивать сельскохозяйственные культуры, предназначенные для биотехнологической переработки в этанол. В условиях дефицита посевных площадей возникает проблема, которая уже в наши дни актуальна для Бразилии и выражается дилеммой: продовольствие или энергия. Производствоэтанола из растительного сырья не является безотходным: на каждый литр спирта при-

ходится 12—14 л сточных вод с высокой концентрацией отходов, опасных для природных экосистем. Проблема рациональной переработки этих отходов не решена.

 

Классическим биообъектом, используемым при получении спирта, являются дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Дрожжи имеют ряд недостатков.

 

1. Конкуренция брожения  и дыхания. Субстрат (например, глюкоза) лишь частично сбраживается до этанола. Оставшаяся часть безвозвратно теряется, превращаясь в результате дыхания в СО2 и Н2О. Процесс необходимо вести в анаэробных условиях или применять мутанты дрожжей, утратившие митохондрии и не способные к дыханию.

 

2. Чувствительность к этанолу, которая снижает выход целевого продукта на единицу объема биореактора. Получены устойчивые к этанолу мутанты, характеризующиеся измененным строением клеточных мембран.

 

3. Отсутствие ферментов, катализирующих расщепление крахмала, целлюлозы, ксилана. Необходим предварительный гидролиз субстрата или засев биореактора смешанной культурой, содержащей, помимо S. cerevisiae, микроорганизмы с соответствующей гидролитической активностью.

 

Бактерия Zymomonas molilis, применявшаяся центральноамериканскими индейцами для сбраживания сока агавы, более эффективно сбраживает сахара и более устойчива кэтанолу. Дальнейшее повышение устойчивости Z. mobilis к этанолу достигается добавлением в среду инкубации Mg2+ и ряда нуклео-тидных компонентов.

 

Термофильные бактерии, продуценты этанола характеризуются высокой скоростью роста и метаболизма, чрезвычайно стабильными ферментами, необычной для остальных бактерий устойчивостью к этанолу (до 15% и более). Термофилы способны к биоконверсии полисахаридных субстратов в этанол.

Так, Thermoanaerobium brockii сбраживаеткрахмал, Clostridium thermocellum — целлюлозу, Cl. thermohydrosulfuricum утилизирует продукты деградации целлюлозы с очень высоким выходом спирта. Перспективно применение экстремально термофильного продуцента спирта Thermoanaerobacter ethanolicus. Планируют использование также ацидофильных (оптимум рН 1,5) и галофильныхпродуцентов спирта.

 

Повышение выхода спирта и стабилизация активности его продуцентов могут быть достигнуты путем иммобилизации клеток. Так, эффективный синтез этанола осуществлен с применением клеток Z. mobilis, иммобилизованных на хлопчатобумажных волокнах (S. Prentis, 1984).

 

Получение метана и других углеводородов.

 

Получение метана — важный путь утилизации сельскохозяйственных отходов. Он получается в виде биогаза — смеси метана и СО2. Присутствие СО2 ограничивает теплотворную способность биогаза как топлива, которая в зависимости от соотношения СН4/СО2 составляет 20,9—33,4 кДж/м3. Содержание метана в биогазе варьирует от 50 до 85%.

 

Непосредственно к образованию метана способна небольшая группа микроорганизмов, относящихся к архебактериям. Жизнедеятельность метанобразующих архебактерийпротекает в строго анаэробных условиях. Субстратами для образования метана могут служить муравьиная и уксусная кислоты, метанол, газовые смеси (Н2 + СО, Н2 + СО2). Поскольку биогаз практически получают из сложных органических веществ (целлюлозы, крахмала, белков, липидов, нуклеиновых кислот), то для метан-образования применяют многокомпонентные микробные ассоциации.

Наряду с метанобразующими бактериями в состав таких ассоциаций входят микроорганизмы, переводящие органические субстраты в метанол, муравьиную и уксусную кислоты, Н2, СО и т. д. Примером может служить метаногенная ассоциация «Methanobacillus Kuzneceovii», образующая метан при разложении биомассы водорослей (Чан Динь Тоай, 1984).

 

Процесс метанобразования отличается высокой эффективностью: до 90—95% используемого углерода переходит в метан. Поэтому метаногенные ассоциации с успехом используют для очистки сточных вод от органических загрязнений с одновременным получением высококалорийного топлива. До 5—10% потребленного углерода превращается в биомассу, которая также находит применение. Используют как жидко-, так и твердофазные процессы получения биогаза (биогазификации).

 

Наряду с биогазом метаногенные ассоциации образуют другие ценные продукты, например витамин В12 После переработки органического субстрата в биогаз остается материал, представляющий собой ценное минеральное (азотное и фосфорное) удобрение.

 

Получение биогаза — процесс, отличающийся простотой оборудования и доступностью сырья, требует небольших капиталовложений. В Китае, Индии, ряде других стран эксплуатируются небольшие установки, в которые вносят подручный материал (солому, навоз и др.), что исключает затраты на доставку сырья. В Китае действует свыше 7 млн. малых установок вместимостью 10—15 л, достаточных для удовлетворения энергетических потребностей семьи из пяти человек.

 

Кроме метаногенных анаэробов существует другая группа организмов — продуцентов углеводородов как заменителей топлива. Это микроводоросли — Botryacoceus, Isochrysis,Nanochlo-ropsis и др. Углеводороды накапливаются в значительных количествах — до 80% сухой массы клеток. В США действует ферма для выращивания водорослей с суммарной площадью водоемов 52 тыс. гектаров, дающая около 4800 м3 жидких углеводородов в сутки. Для улучшения топливных характеристик полученные из водорослей углеводороды подвергают гидрированию (Г Н Чернов, 1982).

 

Получение водорода как топлива будущего.

 

Получение водорода как топлива пока остается на уровне поисковых разработок. Это абсолютно чистое топливо, дающее при сгорании лишь Н2О, отличается исключительно высокой теплотворной способностью — 143 кДж/г. Химический и электрохимический способы получения Н2 неэкономичны, поэтому заманчиво использование микроорганизмов, способных выделять водород. Такой способностью обладают аэробные и анаэробные хемотрофные бактерии, пурпурные и зеленые фототрофные бактерии,цианобактерии, различные водоросли и некоторые простейшие (Е. Н. Кондратьева, И. Н. Го-готов, 1981). Процесс протекает с участием гидрогеназы или нитрогеназы.

 

Гидрогеназа — фермент, содержащий FeS-центры. Она катализирует реакцию

2Н+ + 2е- = Н2

 

Одна из технологических возможностей основана на включении изолированной гидрогеназы в состав искусственных Н2-генерирую-щих систем. Сложной проблемой является нестабильность изолированного фермента и быстрое ингибирование его активности водородом (продуктом реакции) и кислородом. Повышение стабильности гидрогеназыможет быть достигнуто ее иммобилизацией (Чан Динь Тоай, 1984; Y. Nosaka et. al., 1986). Иммобилизация предотвращает ингибирование гидрогеназы кислородом.

 

Предложено много вариантов модельных систем, катализирующих образование водорода из воды за счет энергии света. Эти системы различаются механизмом улавливания энергии света и содержат хлоропласты или изолированный из них хлорофилл, а также восстановленные никотинамидные нуклеотиды. Некоторые системы наряду с водородом образуют кислород: в этом случае речь идет о биофотолизе воды.

 

Примером может служить система хлоропласт — ферредоксин — гидрогеназа. Ферредоксин служит промежуточным переносчиком электронов от фотосинтетической цепи хлоропластов к добавленной гидрогеназе. Серьезной проблемой является поддержание низкого парциального давления этих газов, с тем чтобы не наступило ингибированиегидрогеназы.

 

При замене ферредоксина на флавопротеид или метилвиологен система образует только Н2. Флавопротеид и, по некоторым данным, метилвиологен защищаютгидрогеназу от ингибирования кислородом. Разрабатываются системы с изолированным хлорофиллом, встроенным в детергент ные мицеллы или липосомы вместе сгидрогеназой. Предложена также система с гидрогеназой, иммобилизованной в агарозном геле, с которым прочно связан полимерный виологен и металлопорфирин, аналог хлорофилла.

 

Водород получают также с применением целых клеток микроорганизмов, стабильность которых возрастает при их иммобилизации. Высокоэффективными продуцентами Н2являются пурпурные фототрофные бактерии, например Rhodopseudomonas sp., которые при иммобилизации в агарозном геле дают до 180 мкмоль Н2 за 1 ч в пересчете на 1 мгбактериохлорофилла (М. Tadashi, A. Akira, 1983). Важное направление работ — поиск продуцентов Н2 с устойчивой к О2 гидрогеназой.

 

Другим ферментом, катализирующим выделение водорода, является нитрогеназа. У всех микроорганизмов нитрогеназа состоит из двух, компонентов, а именно из MoFeS-протеида (молибдоферредоксина) и FeS-протеида (азоферредоксина). Основной функцией нитрогеназы является восстановление молекулярного азота:

 

N2 + 8H+ + 8е- + nАТФ -> 2NH3 + Н2 + nАДФ + nфосфорная кислота

 

В отсутствие основного субстрата (N2) нитрогеназа катализирует энергозависимое восстановление Н+ с образованием Н2. Переключение фермента с одного режима работы на другой является технологической проблемой. Один из путей решения — получение штаммов микроорганизмов с нитрогеназой, не утилизирующей азот.

 

В Японии получен штамм Anabaena sp., который осуществляет биофотолиз воды в режиме, не чувствительном к Н2, О2 и N2. Повышению эффективности биофотолиза воды способствует чередование периодов функционирования биообъекта как продуцента Н2 и О2 с периодами «отдыха», когда клетки фотоассими-лируют СО2 (вводимый на этот период в среду культивирования). Возможно комбинирование процессов получения Н2 и других ценных продуктов. В частности, представители рода Clostridium дают органические растворители и в то же время обладают активной гидрогеназой. Если в реакторе с культурой Cl. saccharo-perbutylacetoniocum не создавать оттока для выделяющегося Н2, то наблюдается ингибирование образования Н2 и эффективный синтез бутанола, ацетона и этанола. Если водороду обеспечивают свободный отток, то наряду с довольно активным образованием Н2 культура синтезирует лишь этанол. Этот пример иллюстрирует возможность управления ходом биотехнологического процесса условиями культивирования биообъекта.