Влияние вариабельности физиологических и цитолого-биохимических характеристик на радиочувствительность семенного потомства ольхи

В результате были сформулированы выводы, что семена с модельных деревьев как у березы пушистой, так и у березы бородавчатой различаются по устойчивости к действию ионизирующей радиации; количественная оценка индивидуальной изменчивости радиочув- 
ствительности семян березы бородавчатой и березы пушистой показа- 
ла, что уровень изменчивости всхожести семян без каких-либо допол- 
нительных воздействий у березы бородавчатой ниже, чем у березы пу- 
шистой. Облучение семян в больших дозах радиации вызвало сильное 
повышение уровня изменчивости, выявило разнородность семян, с раз- 
ных деревьев в выборке по их радиоустойчивости.  Увеличение  ампли- 
туды изменчивости после воздействия высоких доз радиации наблюда- 
лось в относительно большей степени у березы бородавчатой по срав- 
нению с березой пушистой и уровень внутривидовой индивидуальной изменчивость радиочувствительности семян у обоих видов березы   превышает изменчивость межвидовую. Это обстоятельство необходимо учитывать при сравнении разных видов по реакции на облучение.

    

 

 

2. Материал и методики

 

2.1. Характеристика  ольхи кустарниковой

Ольха кустарниковая (Alnus fruticosa Rupr.). Растение с сидячими островатыми смолистые почками, с 3-5 покровными чешуями.  Листья очень мелко– и острозубчатые, острые, ярко-зеленые. Женские сережки завершают облиственный побег. Встречается в подлеске сосняков, лиственничников  и редкослойных ельников; у ручьев; в подгольцевом  поясе и в лесотундре – обычно вместе с кедровым слаником и березой Миддендорфа. Все районы Якутии (Андреев и др., 1974).

В экспериментах  были использованы семена ольхи кустарниковой, индивидуально с каждого растения, произрастающей в условиях разных природных радиационных фонов (ПЕРФ) – 20, 100, 300, 500 и 700 мкР/ч.  Семена были собраны в 2002 году.

 

2.2. Лабораторный посев  семян

 Воздушно-сухие семена  ольхи  проращивали в чашках  Петри, на фильтрах, в 3-х повторностях  по 50 штук в каждой,  при комнатной  температуре (20-24⁰ С),  с длинной дня – 16 ч и ночи – 8 ч. Энергию прорастания (%) определяли на 7 день, всхожесть семян (%)  – на 14 и выживаемость проростков (%)  – на  30 день наблюдения.

 

2.3. Облучение семян

Воздушно-сухие семена облучали g-квантами ⁶⁰Со на установке типа "Исследователь" при мощности дозы  10,4 рад/с в диапазоне доз от 10 до 500 Гр, на биофизической станции г. Заречный Института экологии растений и животных УрО РАН (г. Екатеринбург). Основным критерием оценки  радиочувствительности  семян являлась выживаемость проростков   на 30 день наблюдения, когда появился настоящий лист. Установлено, что наибольшую информативность для  оценки радиочувствительности показывает критерий выживаемости на стадии образования первого листа. Так как на этой стадии, когда начинают активно функционировать меристемы – критические ткани растений (Гродзенский, 1989), наиболее ярко проявляются отдаленные последствия облучения семян, вплоть до массовой гибели проростков. Поэтому  устойчивость семян к  g-облучению оценивалась по критерию появления настоящего листа (меристематической выживаемости) у проростков.

 

2.4. Анализ кривых «доза-эффект»

Для выявления радиочувствительности  семенного потомства с разных ПЕРФ произрастания ольхи кустарниковой  нами был применен анализ кривых «доза-эффект» (рис.2.1; Журавская и др., 1993б). Суть анализа в следующем. Дозовая кривая в натурально-логарифмических координатах была разделена на две части. Первая часть (плечо дозовой кривой – АВ) – диапазон доз, в котором сохраняется способность организма поддерживать гомеостаз, несмотря на усиливающееся действие фактора. Проецируя длину плеча (L) на ось абсцисс, получали количественную характеристику квазипороговой дозы (Dq) или дозы перегиба. Механизмы, обеспечивающие постоянство внутренней среды при возрастающих дозах облучения, могут быть различны. Адаптационный потенциал складывается из наличия в клетках эндогенных протекторов, эффективной работы систем репарации, особенностей строения генома и т.д. (Гродзинский, 1983). Мерой способности организма приспосабливаться к нарастающему облучению, сохраняя гомеостаз, и является величина Dq.

Вторая часть дозовой  кривой в натурально-логарифмических координатах (ВС; рис. 2.1) характеризовалась обратно пропорциональной зависимостью интенсивности выживаемости проростков от величины дозы облучения. Количественной ее оценкой является тангенс угла наклона (tga), величина которого была тем больше, чем быстрее гибли растения в интервале более высоких доз радиации.

 

 

 

 

Ln признака
	ln дозы

 

Рис.2.1. Кривая «доза-эффект», выполненная в логарифмическом  масштабе  

 

Наклонный участок дозовой  кривой характеризует второй тип  устойчивости – резистентность самих приспособительных систем, включая системы репарации.

Анализ кривых «доза-эффект»  в натурально логарифмических координатах позволяет судить о степени радиочувствительности вида, включая уровень эндогенных радиопротекторов, активность и устойчивость репарационных систем.

 

2.5. Определение количества  низкомолекулярных антиоксидантов  в проростках (НМАО) [Асатиани, 1969]

Для определения НМАО отбирали определенную навеску массы проростков (0,3-0,5 г.) и гомогенизировали ее в ступке. Экстракцию проводили 3-6 мл 50%-ного водного раствора этанола. При этом экстрагировались как гидрофильные (аскорбат, мочевая кислота, тиомочевина, SH-аминокислоты, белки-акцепторы ^·О₂^- и др.) так и липофильные (a-токоферол, убихиноны, каротиноиды и др.) антиоксиданты. Экстракты центрифугировали в течение 10 минут при 3000 g.

Метод определения суммы антиоксидантов основан на окислении антиоксидантов хлоридом железа (III). При этом хлорид железа (III) восстанавливается до хлорида железа (II), количество которого определяется по интенсивности окраски при добавлении о-фенантролина при длине волны 490-510 нм. Однако эта методика определения суммы НМАО, не учитывает реакцию комплексообразования некоторых НМАО (например фенолов) с ионами Fe³⁺, которая вносит свой вклад в величину оптической плотности, что приводит к искажению результатов определения суммарного содержания АО.

В связи с этим применялась модифицированная методика (Журавская, 2001). Для более точного определения концентрации НМАО, ввели наряду с раствором сравнения №1, содержащего избытки хлорида железа (III) и о-фенантролина, раствор сравнения (№2), содержащий избыток хлорида железа (III) и анализируемый раствор антиоксидантов. Раствор сравнения № 2 учитывает процесс комплексообразования фенольных антиоксидантов с ионами Fe³⁺. Раствор сравнения №1 готовили один раз перед серией измерений и вводят в память процессора спектрофотометра, так как он учитывает оптическую плотность комплекса, образованного реактивами – [о-фенантролин]₃ Fe³⁺, постоянную на протяжении всех измерений. Раствор сравнения №2 готовили перед каждым измерением оптической плотности, так как в каждой пробе содержатся различные концентрации АО.

Раствор сравнения №1 готовили следующим  образом. В кварцевую кювету (L=1 см) вносили 0,2 мл 0,2%-ного раствора хлорида железа (III) в 96%-ном этаноле, 0,2 мл 0,5%-ного раствора о-фенантролина в 96%-ном этаноле и 2,6 мл 96%-ного этанола. Перемешивали содержимое кюветы и измеряли величину оптической плотности при l=510 нм на спектрофотометре DU-650 фирмы Cary 3E (США).

Измерение  ΔD₅₁₀ опытной пробы совмещали с измерением  ΔD₅₁₀ раствора сравнения №2. В кювету (L = 1 см) вносили 0,2 мл 0,2%-ного раствора хлорида железа (III) в 96%-ном этаноле, 0,2 мл раствора анализируемого экстракта и 2,4 мл 96%-ного этанола. Содержимое кюветы перемешивали. Через 2 минуты измеряли ΔD₅₁₀ (ΔD₅₁₀ раствора сравнения №2). Затем в кювету добавляли 0,2 мл 0,5%-ного раствора о-фенантролина в 96%-ном этаноле, выдерживали в темноте 10 минут и вновь измеряли  ΔD₅₁₀ (ΔD₅₁₀ опытной пробы). Разведение анализируемой пробы должно быть таким, чтобы измеренная величина ΔD₅₁₀ опытной пробы находилась в интервале от 0,6 до 1,3 ΔD₅₁₀, т.к. в этом интервале сохраняется прямолинейность зависимости ΔD₅₁₀ от концентрации антиоксидантов.

С использованием серии стандартных растворов дигидрата кверцетина в диапазоне концентраций 0,10–0,025 мг/мл было получено значение коэффициента экстинкции комплекса [о-фенантролин]₃ Fe²⁺ (e₅₁₀) по кверцитину - 5,28 10⁴ М^-1 см^-1.

Суммарное содержание низкомолекулярных антиоксидантов (в мг-экв кверцетина/г) находили по формуле:                                    

 S(НМАО) = 2 * (D_эксп – (D_К1 – D_К2)) * V_развед  * V_{экстракта}/ e₅₁₀ * m    (3)

 где D_эксп – оптическая плотность исследуемой реакционной смеси,

      D_К1 – оптическая плотность раствора сравнения №1,

      D_К2 – оптическая плотность раствора сравнения №2,

      V_развед – объем разведения, мл,

      V_{экстракта} – объем экстракта, используемый для анализа, мл,

      e ₅₁₀ –молярный коэффициент экстинкции при l=510 нм,равен

5,28*10 ⁴ М^-1*см^-1,

      m – масса  исследуемого материала, г,

 

 

2.6. Комплексный цитолого-биохимический  метод дифференциальной оценки активности генома в процессах репликации, трансляции,  репарации и его общей устойчивости

 Часть известных в настоящее время методов оценки активности систем репарации ДНК дают детальную информацию об активности специфических ферментов известных систем репарации. Однако, для того чтобы оценить общую активность систем репарации необходимо определить активность как минимум 7 ферментов, являющихся лимитирующими в них (Сойфер, 1997). Такой подход является весьма дорогостоящим, требует достаточно длительного времени для проведения и поэтому мало пригоден для широкомасштабного использования при решении экологических и медицинских задач. Кроме того, весьма вероятно, что существуют и другие системы репарации, ферменты которых в настоящее время еще неизвестны. Поэтому, определяя в отдельности активности каждой из известных систем репарации, нельзя получить исчерпывающей информации о состоянии репарационных систем.

Сотрудниками Межведомственной лаборатории  экологической биохимии ИБПК СО РАН был разработан комплексный цитолого-биохимический метод прямой оценки интегральной активности систем репарации генома, являющийся достаточно простым, дешевым и быстрым в проведении. Кроме того, он позволяет, в относительных единицах, оценить активность генома в процессах направленных на трансляцию, репликацию, а также интегральную устойчивость генома (Журавская, 2001).

Метод включает одновременное определение скорости включения ³Н-тимидина в молекулы ДНК и ¹⁴С-лейцина в синтезируемые белки методом двойной метки, а также определение митотического индекса быстро делящихся растительных клеток корневой меристемы проростков. Для оценки процесса транскрипции в методике применялся меченный лейцин, который включается в синтезируемые клеткой белки и может отслеживаться по ß-излучению. Благодаря этому можно в относительных единицах выразить скорость синтеза белков и тем самым проанализировать способность процессов транскрипции  индивидуумов.

Для того чтобы оценить общую активность систем репарации был взят меченный радиоактивным углеродом тимидин. Данная аминокислота, которая входит в состав только ДНК и больше никуда не включается, может дать информацию о скорости синтеза ДНК. Благодаря этому можно изучить индивидуальность объектов исследования, как между видами, так и внутри вида.

Методика введения двойной  метки была использована в следующей  модификации (Остерман, 1983). Корешки проростков отделяли и помещали на 24 часа в инкубационную среду, состоящую из 0,1 М Na-фосфатного буфера рН=7,4, 1%-ного раствора сахарозы с добавлением ³Н-тимидина (2,2 ПБк/моль) и ¹⁴С-лейцина (1,97 ТБк/моль) по 100 ml каждого. Затем корешки гомогенизировали в 3 мл 0,1 М Na-фосфатного буфера рН=7,4 и центрифугировали при 5000 об./мин в течение 10 минут. Белки и нуклеопротеиды осаждали из супернатанта добавлением 1 мл 5%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, отделяли их фильтрованием, промывали 45%-ным раствором этанола для удаления не включенных в биополимеры ³Н-тимидина и ¹⁴С-лейцина. Радиоактивность фильтров измеряли по программе двойной метки в толуольном сцинтилляторе на жидкостном сцинтилляционном счетчике «Rackbeta II» фирмы Фармация-Валлак (Остерман, 1983). Одновременное определение включенного в молекулы ДНК ³Н-тимидина и в белки ¹⁴С-лейцина возможно, так как диапазон спектров импульсов испускаемых b-излучений у ³Н и ¹⁴С различны и регистрируются в отдельных каналах: для ³Н - 8-110, а для ¹⁴С - 70-165. Перекрывание составляет 18%, которое учитывается при расчетах.

 

Активность включения ³Н-тимидина в молекулы ДНК и ¹⁴С-лейцина в синтезируемые белки рассчитывалась по следующим формулам:

 

Активность                           (СРМ – СРМ_фл) * V_развед

включения ³Н-тимидина =                                               ;      

(фмоль/г сутки)                      79,2 * m * V_ф

 

 

Активность                           (СРМ – СРМ_фл) * V_развед

включения ¹⁴С-лейцина =                                                 ;      

(фмоль/г сутки)                      0,11 * m * V_ф

 

где: СРМ – счет импульсов в  минуту;

СРМ_фл – фон флаконов;

V_развед – объем разведения (объем боратного буфера, использованный для гомогенизации + ТХУ, использованный для осаждения ДНК-белкового комплекса), мл;

V_ф – объем исследуемой суспензии, пропускаемой через  фильтр, мл;

m – масса проростков, г;

79,2 и 0,11 –  константы.

В рамках предлагаемого метода активность генома оценивали:

– в процессах трансляции белков с t_1/2 не менее суток, на стадиях I, II, V клеточного цикла (схема 2.1) – по скорости включения в синтезируемые белки ¹⁴С-лейцина;