Дослідження білків білку яйця перепілки

 

 

Міністерство освіти і науки України

Національний університет «Києво-Могилянська академія»

Факультет природничих наук

Кафедра біології

 

 

 

 

 

Звіт

з проходження лабораторного практикуму з курсу

«Фізико-хімічні методи в біології»

на тему:

«Дослідження білків білку яйця перепілки»

 

 

 

 

Виконала

Студентка ФПрН-3 (біологія)

************ ****

 

 

 

 

Київ – 2013 
ЗМІСТ

ВСТУП……………………………………………………………………………..3

РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ………………………………………………..4

1.1. Вміст яєчного білку…………………………………………………………..4

1.2. Методи виділення та дослідження білків…………………………………...5

1.2.1. Висолювання, як один із методів фракціонування………………………5

1.2.2. Діаліз…………………………………………………………………….…..6

1.2.3.Спектрофотометрія………………………………………………………….6

1.2.4. Метод Лоурі………………………………………………………………...7

1.2.5. Хроматографія……………………………………………………………...8

1.2.6. Гель-електрофорез білків…………………………………………………..9

РОЗДІЛ 2. ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА………………………….......11

2.1. Матеріали та методи………………………………………………………...11

2.1.1. Виділення білків…………………………………………………………..11

2.1.2. Очищення білків…………………………………………………………..12

2.1.3. Визначення концентрації білка…………………………………………..13

2.1.4. Розділення  білків   методом  колонкової хроматографії……………….13

2.2. Результати досліджень та  їх обговорення…………………………………14

2.2.1. Виділення білків…………………………………………………………..14

2.2.2. Очищення білків…………………………………………………………..15

2.2.3. Визначення загальної кількості  білка……………………………………15

2.2.4. Розділення  білків методом  колонкової хроматографії………………...15

2.2.5. Дослідження концентрації білку  після хроматографії………………….16

2.2.6. Гель-електрофорез………………………………………………………...17

ВИСНОВКИ……………………………………………………………………...19

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ………………………………………………………...20

 

ВСТУП

 

Білки є невід’ємною частиною кожного організму, порушення якої може викликати його руйнування.  Оскільки білки разом з нуклеїновими кислотами є найважливішими компонентами живого організму, то їх дослідження буде актуальним в усі часи. Так звана «класика» біологічних досліджень.

Нині безліч дослідників розглядають різноманітні білки в якості об’єктів. Крім того важливими є дослідження білків в клінічних лабораторіях тощо. Тому важливою ланкою для науковців та медичних співробітників є розвиток все більшої кількості методів для дослідження білків, як макромолекул.

К залежності від мети та об’єкту дослідження кожен дослідник обирає та використовує різні методи, проте існують основні методики, які необхідно знати.

Метою даної роботи є дослідження білкового складу яєчного білку перепелиного яйця, що корелює з використанням,  вивченням та опануванням деяких фізико-хімічних методів.

У відповідності до мети було поставлено такі завдання:

1. Проаналізувати дані літератури щодо складу перепелиних яєць;
2. проаналізувати дані літератури щодо методів, необхідних для аналізу досліджуваного білка;
3. провести висолювання білку сульфатом амонію та очистку досліджуваного матеріалу.
4. за допомогою фізико-хімічних методів, визначити концентрації, визначити кількості та розділити суміш білків.
5. Проаналізувати результати дослідження.

 

 

 

РОЗДІЛ 1

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

 

1. Вміст яєчного білку

 

До складу яйця входять різні речовини, які необхідні для забезпечення росту та розвитку майбутньої пташки.

Перепелині яйця вважають більш насиченими поживними речовинами ніж курячі. Хімічний склад перепелиних яєць може відрізнятися в залежності від різних чинників, проте, в незначних межах.

Перепелині яйця характеризують, як натуральний вітамінний комплекс, який володіє унікальними властивостями. Вони багаті вітамінами, мікроелементами та амінокислотами. Основну масу перепелиного яйця, власне, як і курячого – становить вода [8].  Менше в яйці органічних сполук, це, в основному білки та жири. Вуглеводи в  яйцях практично відсутні. В 1 г перепелиного яйця міститься в 2,5 рази більше вітамінів, у порівнянні з курячим. Кількість фосфору, калію, заліза в яйцях перепелів перевершує курячі яйця в 4,5 рази [5, 8].

Харчова цінність перепелиного яйця на 100 г становить 168 ккал або 702 кДж. Загальний вміст білків яйця становить 13,1%, жирів – 11,9%, вуглеводів – 0,6%.

Перепелині яйця складаються з білку (56-61%) та жовтку (27-33%), а також шкарлупи. Основна кількість білків (протеїнів) припадає на білковий вміст, жовтки також містять білки, однак в менших кількостях, крім того в жовтках наявні також холестерол та жири[4, 6].

Білок яйця являє собою колоїдний розчин, густина якого становить 1,035 [6]. До складу білку яйця входить прилизно 85% води, близько 12,7% загальної маси білку складають власне білки, з них основними є:

1. Овальбумін (близько 54% всіх білків) – це альбумін, що є основним білком яєчного білку. В очищеному вигляді його молекулярна маса становить 45 кДа, при висолюванні випадає в осад при насиченні розчину сульфатом амонію більше 60% [3];
2. овотрансферин або кональбумін (близько 12-13%);
3. лізоцим (3,4-3,5%);
4. овомукоїд.;
5. овомуцин;
6. овоглобуліни (2%), їх молекулярна маса складає приблизно 35 кДа;
7. також найвний білок авідин, який в білку знаходиться в комплексі з біотином – 1молекулаавідину на 3 молекули біотину[5,6,8].

Окрім того у складі білка перепелиних яєць, наявнапевна кількість ферментів, таких як протеази, амінопептидази, каталази, оксидази, та інші; вітаміни, такі як ретинол, вітаміни В1 (тиамін), В2 (рибофлавін), В5(пантотенова кислота), В9 (фолацин), В12 (кобаломін), вітамін D, а також  мікроелементи, а саме -  кальцій, цинк, залізо, магній, фосфор, калій [6, 8].

Яєчний білок є хорошим об’єктом для дослідження в лабораторних умовах, оскільки є зручним у використанні і для подальших досліджень не потребує довгочасного процесу підготовки та гомогенізації зразку, і після виділення з яйця може одразу бути використаним для досліджень.

 

2. Методи виділення та дослідження білків

 

1. Висолювання, як один із методів фракціонування.У воді білкова молекула утримується в розчиненому стані за рахунок свого заряду, а також наявності гідратаційної оболонки.

Одним із методів переведення білків із розчиненого стану в нерозчинний з можливістю повернення молекул у вихідний стан є висолювання. Цей процес полягає в тому, що під дією нейтральних солей амонію, лужних і лужноземельних металів білки в розчині випадають в осад, і осадження є зворотнім. Тобто при видаленні компонентів-осаджувачів із розчину білки знову переходять у розчинений стан. На процес висолювання можуть впливати різні фактори, такі як молекулярна маса білка, його заряд, природа солі та умови проведення висолювання [1, 2].

Оскільки різні білки випадають в осад при різний концентрації солей, то, завдяки процесу висолювання можна їх фракціонувати.

Історично склалося, що найбільш часто використовують для висолювання сульфат амонію, оскільки він має ряд переваг, серед яких низька вартість, зручність у використанні, чіткість результатів. Крім того сульфат амонію здатний справляти стабілізуючу дію на деякі білки. Його можна використовувати як  сухий (NH4)2SO4, так і насичений розчин сульфату амонію [2].Літературні  дані зазначають, що для висолювання альбуміну сульфатом амонію необхідно наситити досліджуваний розчин приблизно 70% (NH4)2SO4, глобуліни висолюються з розчину при насиченні 50% [7].

2. Діаліз. Діалізом називають процес вивільнення з колоідних розчинів та субстанцій високомолекулярних речовин відносно низькомолекулярних сполук за допомогою напівпроникної мембрани [1,2].

При діалізі молекули розчиненоїнизькомолекулярноїречовинипроходять через мембрану, а більші частинкизалишаються за нею. Найпростішийдіалізаторявляє собоюдіалізниймішок з напівпроникногоматеріалу, в якомузнаходитьсядосліджуваний розчин. Мішок може мати різний розмір пор, в залежності від того, які речовини і від чого очищують. Діалізний мішокзанурюють в розчин (наприклад у  робочий буфер). Низькомолекулярні речовини шляхом дифузії проходять через пори мембрани в оточуючий розчин.Змінюючирозчин, можнадомогтися практично повного, відносно швидкогоочищеннявіднебажанихдомішок.

Цей метод добре підходить для очищення білкового розчину від молекул осаджувача – сульфату амонію.

3. Спектрофотометрія. Спектрофотометрія – це метод аналізу, що базується на визначенні спектра поглинання або вимірюванні світлопоглинання при певній довжині хвилі, яка відповідає максимуму кривої поглинання досліджуваної речовини. Аналізвідбувається з поглинаннямречовинамимонохроматичноговипромінювання у видимій, УФ- і ІЧ-ділянках спектра [2].

Застосування в аналізі методу спектрофотометрії, як і іншихфотометричнихметодів, ґрунтується на використанні для визначенняконцентраційречовин закону Бугера–Ламберта–Бера. Тому визначають пропускання речовин, а також екстинцію,що є велечиною обернено пропорційною до пропускання.

 Основним видом  приладів для даного методу  є спектрофотометри, в яких, на відміну від фотоелектроколориметрів, монохроматизація забезпечується не світлофільтрами, а спеціальними оптичними пристроями — монохроматорами, які дозволяють безперервно змінювати довжину хвилі електромагнітного випромінювання, що проходить крізь розчин, який аналізують [9].

Метод спектрофотометрії має ряд переваг, таких як забезпечення цілісності зразку, високої чутливості, можливості застосування широкого діапазону хвиль, крім того цей метод піддається автоматизації.

За допомогою цього методу можна досліджувати як безбарвні так і забарвлені розчини. Наприклад, наявність білків в розчині найчастіше визначаються за допомогою спектрофотометрії при довжині хвилі 280 нм. Це зумовлено здатністю певник амінокислот, що входять до складу білків, а саме ароматичних амінокислот -- триптофана, тирозина, і меншою мірою фенілаланіна, поглинати ультрафіолетове випромінювання при цій довжині хвилі. Пов’язаними із методами спектрофотометрії є методи колориметрії, один з яких є метод Лоурі[1,2,9].

4. Метод Лоурі.Для кількісного визначення низьких концентрацій білку широко використовують метод Лоурі, запропонований в 1951 р. Суть цього методу полягає  в тому, що в ньому сполучаються 2 різні реакції. Перша – це біуретова реакція під час якої пептидні зв’язки утворюють комплекси з іонами міді (це відбувається в лужному середовищі). Друга реакція – реакція Фоліна, під час якої відбувається взаємодія тирозинів та триптофанів, які входять до складу білку з реактивом Фоліна-Чокальтеу (фосфомолібденова кислота з фенолом). Під час цієї взаємодії відбуваються утворення нестабільних комплексів,  що переходить в молібденову синь, яка має максимум поглинання при довжині хвилі 750 нм.

Дана реакція дозволяє виявляти білки в досить низьких їх концентраціях (10-60 мг/л). проте значним недоліком цього методу є досить низька специфічність, через що реакція може відбуватися і в присутності інших небілкових речовин [9].

5. Хроматографія. Хроматографія – високоефективний фізико-хімічний метод розділення і аналізу, в якому речовина розподіляється між двома фазами: рухомою і нерухомою [2].

Розрізняють різні види хроматографування, їх класифікують за різними принципами. Залежно від агрегатного стану рухомої фази розрізняють рідинну та газову хроматографію. За принципом фракціонування – гель-фільтрація, розподільча, адсорбційна, іонообмінна хроматографія. За способом елюції – фронтальний аналіз, витискувальна хроматографія, хроматографічна елюція. За розташуванням нерухомої фази  - колонкова хроматографія та хроматографія на пластинках [1, 2].

Розділення білків часто проводять у колонці, використовуючи методи гель-фільтрації.Гель-фільтрація – це метод розділення суміші речовин з різними молекулярними масами шляхом їх фільтрації крізь так звані «лункові» гелі. Найчастіше для гель-фільтрації використовують в якості сорбенту сефадекси, які являють собою декстрини, які утворюють полімерні ланцюги завдяки α-1-6-глікозидних зв’язків. Декстрини зшивають за допомогою епіхлоггідрину, таким чином утворюється так звана лункова структура. Гранули сефадекса легко набухають у водному середовищі, завдяки великому вмісту гідроксильних груп. Утворюється гель, за допомогою якого заповнюють колонку для хроматографії. Чим більшу кількість води сефадекс здатен сорбувати під час набухання, тим вищий його номер.  Робочий діапазон рН складає 2-10.