Дослідження білків білку яйця перепілки

Після заповнення колонки сефадексу він, разом із сорбованою рідиною, являє собою нерухому фазу хроматографії. На поверхню його наносять досліджувану суміш та пропускають елюент через колонку. Разом з фронтом елюенту рухаються і молекули білків. Ті, що мають високу спорідненість до лунок сорбенту – затримуються в ньому, ті, що мають меншу спорідненість – проходять колонку швидше. Величина лунок визначає розмір молекул, які можуть проникати всередину гранул [1,2].

6. Гель-електрофорез білків. Електрофорез  —  спрямований рух колоїдних частинок або макроіонів під дією зовнішнього електричного поля. Базується цей метод на тому, що речовини в водному середовищі дисоціюють, утворюючи заряджені частинки, і ці частинки здатні до руху в електричному полі  -- катіони до катоду, аніони до аноду. Білки мають молекули різних зарядів, тому напрямок іх руху визначається їх сумарним зарядом. Метод дозволяє розділяти макромолекули, що розрізняються по таких найважливіших параметрів, як розміри (або молекулярна маса), просторова конфігурація, вторинна структура і електричний заряд, причому ці параметри можуть виступати як окремо, так і в сукупності (Остерман Л.А. - Методи дослідження білків і нуклеїнових кислот: Електрофорез і ультрацентрифугування).

Найкращий ефект розділення білків досягають за допомогою гель електрофорезу. Високу роздільну здатність гель-електрофорезу пояснюють ефектом «молекулярного сита», яке утворюється молекулами гелю, «зшитими» між собою. Принцип дії молекулярного сита полягає в тому, що великі молекули будуть рухатись тим повільніше, чим менші пори в структурі гелю. Розміри пор гелю визначаються числом поперечних зшивок між полімерними ланцюгами. В якості носія можна використовувати різні гелі, проте найефективнішими вважають поліакриламідні гелі.  Поліакриламідні гелі мають ряд переваг, а саме:

1. розмір пор може коливатись в широких межах;
2. гелі можна формувати в каліброваних контейнерах;
3. гелі характеризуються дуже низьким рівнем адсорбції і електроосмосу;
4. поліакриламідні гелі можна застосовувати з різними буферами;
5. процес розділення проходить дуже швидко.

Денатуровані білки рухаються в  гелі тим швидше, чим менша їх молекулярна маса. Якщо ж білки попередньо не денатуровані швидкість їх руху  залежатиме ще й від величини, форми молекул та їх сумарного заряду.

Для візуалізації білкових фракцій після електрофорезу гель обробляють барвником, який здатний зв’язуватись із білковою молекулою, але не з гелем. Зазвичай, використовують кумасі синій. Після обробки барвником гель відмивають і оцінюють результат.  Молекулярну масу досліджуваного білка можна легко визначити, якщо використовувати маркери – білки відомої молекулярної маси.

 

РОЗДІЛ 2

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА

 

2.1. Матеріали  та методи

 

Для проведення ряду досліджень лабораторного практикуму було заздалегідь приготовано деякі реактиви:

1. 10 мл стандартного розчину білка концентрацією 1 мг/мл;
2. 500 мл реактиву А для методу Лоурі;
3. 100 мл реактиву В для методу Лоурі;
4. 2 л калій-фосфатного буферу концентрацією 0,4 Моль/л, рН=7,3;
5. 100 мл фізіологічного розчину NaCl0,9%;
6. 10 г сухого порошку сульфату амонію;
7. 200 мл насиченого (70%) розчину сульфату амонію;
8. По 10 мл розчинів BaCl та BaOH 1%.

2.1.1. Виділення  білків. Об’єктом для дослідження було обрано – перепелині яйця (оскільки основний вміст білку в яйцях міститься в яєчному білку– досліджували саме білок). Для дослідження було взято яєчний білок з 5-ти перепелиних яєць. За допомогою чистого металевого скальпеля розбивали шкарлупу яєць. Методом послідовного переливання відділяли жовток від білку та зливали білок у мірний циліндр. Об'єм досліджуваного матеріалу – становить 25 мл.

Досліджуваний матеріал розводили в 4 рази за допомогою фізіологічного  розчину (0,9% NaCl) в 4 рази (1:3). До 25 мл досліджуваного білку додавали 75 мл фізіологічного розчину.

Вихідний об'єм  досліджуваного розчину становив 100 мл.

Висолювання досліджуваного розчину проводили поетапно, для одержання насичення розчину 25%, 50% та 75%. Використовували сухий порошок сульфату амонію, тому кількість (NH4)2SO4розраховували за формулою:

,

де:

Х – кількість грамів сульфату амонію;

V – об’єм вихідного розчину;

С2 – необхідний ступінь насичення.

Порошок всипали невеликими порціями, рівномірно, при постійному перемішуванні за допомогою магнітної мішалки (для рівномірного висолювання).

Після того, як отримували осад від певного насичення – центрифугували його. Першу фракцію (насичення (NH4)2SO4 = 50%) центрифугували в скляних центрифужних пробірках  у лабораторній центрифузі ОПН-8 (Росія) протягом 5 хв, за швидкості в 3000 об/хв. Супернатант зливали до хімічного стакану для подальшого висолювання. Осад вимивали із пробірок за допомогою 0,05М калій-фосфатного буферу (рН=7,3) і залишали для діалізу.

Кількість сульфату амонію для подальшого висолювання розраховували за відповідною формулою, вказаною вище, після осад відцентрифуговували в пластикових центрифужних пробірках протягом 5 хв за швидкості 5000 об/хв. Осад вимивали за допомогою 0,05М калій-фосфатного буферу (рН=7,3) і залишали для діалізу.

2.1.2. Очищення білків. Отримані розчини  помістили у заздалегіть підготовані, та провірені на відсутність пошкодженньдіалізні мішки. Діалізні мішки із зразками перенесли у підвішеному стані у хімічний стакан об’ємом 2л з калій-фосфатним 0,05М буфером. Хімічний стакан поміщали на магнітний перемішувач та поміщали в холодильну камеру за температури +4о С. Зовнішній буфер оновлювали в стакані через кожну годину протягом 3-х годин. Забрудненість буферу сульфатом амонію перевіряли за допомогою 1% розчину BaCl2, утворення осаду свідчить про наявність в буфері молекул сульфату амонію та необхідність продовжувати діаліз. Через 2 дні знову оновлювали буфер через кожну годину протягом 4-х годин, доки зовнішній буфер перестав реагувати із BaCl2.

2.1.3. Визначення  концентрації білка. Для визначення концентрації білка в розчині використовували метод Лоурі.Для цього попередньо будували кілібрувальний графік залежності екстинції від концентрації білку при виконанні методу Лоурі. Для цього, використовували стандартний розчин білку, який попередньо було розведено до відомих концентрацій: 0,5 мг/мл, 0,25 мг/мл, 0,125 мг/мл, 0,62 мг/мл.

Далі розчини відомої концентрації спектрофотометрували на СФ-46, при довжині хвилі 750 нм. За результатами спектрофотометра будували калібрувальний графік, за яким визначали концентрацію білків в досліджуваному розчині (див. рис 2.1).

 

Рис. 2.1. Калібрувальний графік для визначення концентрацій білку за методом Лоурі.

2.1.4. Розділення  білків   методом колонкової хроматографії. Для проведення хроматографії було використано колонку довжиною 68 см, та діаметром 1,5 см. В якості сорбенту для заповнення колонки було обрано попередньо підготовлений сефадекс G-100. В якості фільтрів використовували вату та фільтрувальний папір. Наносили 2 мл досліджуваного зразку загальною концентрацією 5,125 мг/мл (як було визначено попередньо за методом Лоурі, та відповідно теоретично розраховано). За розрахунками, було внесено 10,25 мг білку. В якості елюенту використовували калій фосфатний буфер робочої концентрації 0,05М рН=7,3. Під час проведення хроматографії було встановлено робочу швидкість, яка становила 3 мл за 3 хв 25 с. Було зібрано 183 мл рухомої фази, що пройшла через колонку. Збирали через кожні 3 мл.

Проводили спектроскопію рухомої фази з кожної із 61 пробірок на приладі СФ-46, з використанням кварцевих кювет при довжині хвилі 280 нм. За даними екстинції будували графік її зміни. Визначали наявність білків в зразках за піками на графіку. Після чого збирали зразки в яких були наявні білки та визначали їх концентрацію за допомогою методу Лоурі.

2.1.5. Гель-електрофорез.Виконували вертикальних гель-електрофорез в поліакриламідному гелі. Використовували 30% акриламід. Гель робили 2-шаровий, з концентруючим та розділяючим шарами. Білкові матеріали попередньо денатурували шляхом проварювання протягом 3-х хвилин. Електрофорез проводили в трис-гліциновому буфері. Силу струму збільшували від 15 до 75 мА. Фарбували екстракційним буфером.

 

2.2. Результати  досліджень та їх обговорення

 

2.2.1. Виділення  білків.

Було виділено 25 мл яєчного білку перепелиних яєць, які надалі розводили з 75 мл фізіологічного розчину  NaCl та піддавали висолюванню сульфатом амонію. Завдяки висолюванню було виділено 2 фракції, які було зібрано за допомогою центрифугування: перша - білки, що випали в осад при насиченні (NH4)2SO450%, друга фракція – при насиченні 75%. Можливі були втрати матеріалу під час переливання його в різний посуд та вимивання осаду після центрифугування.

2.2.2. Очищення  білків. Очищення білків від сульфату амонію проводили за допомогою діалізу протягом 3-х днів. Буфер для діалізу змінювали в загальній кількості 7 разів. Було остаточно проконтрольовано останню порцію буферу на відсутність в ньому сульфату амонію. Проте після виділення білкового розчину було помічено осад у фракції номер 2, яка теоретично відповідала альбумінам. Наявність осаду після діалізу можна пояснити недостатньо ретельним проведенням процесу висолювання. Оскільки можливе було нерівномірне осадження та злипання білків, що могло б заважати успішному завершенню процесу діалізу. Через наявність осаду довелося розводити осад другої фракції окремо в 15 мл буферу – штучно створили фракцію 2*. Отже після діалізу біло зібрано 27 мл розчину фракції 1, 58 мл фракції 2, і  15 мл фракції 2* .

2.2.3. Визначення загальної кількості білка. Концентрацію білку визначали за методом Лоурі з використанням калібрувального графіку. За допомогою калібрувального графіку було визначено, що концентрації фракцій 1, 2 та 2* становлять відповідно 4.5, 7.5 та 2.5 мг/мл. Ряд розрахунків привів до результату,  що загальна кількість білків становить 0,6 г із 25 мл яєчного білку. Ці дані є майже в 5 разів меншими за теоретично можливі, що свідчить про значну втрату білків.

Цю втрату можна пояснити неправильним процесом висолювання та втратами під час збирання матеріалу з діалізних мішків.

2.2.4. Розділення  білків методом колонкової хроматографії. Теоретично було визначено, що для внесення 10 мг білку з вмістом подібним до того, який було отримано після висолювання, необхідно було приготувати зразок, об’ємом 2 мл. Для приготування 2 мл зразку для нанесення було використано  0,5 мл зразку фракції №1, 1 мл зразку №2 та 0,2 мл зразку №2*, доводили до 2-х мл за допомогою робочого калій-фосфатного буферу.

Після проведення хроматографії біло зібрано 183 мл рухомої фази, що пройшла через колонку в 61 пробірку по 3 мл. Кожні 3 мл було перевірено на СФ-46 проти робочого буферу та побудовано графік наявності білку з пробірках (рис. 3.1).

Рис. 3.1. Графік зміни екстинції вмісту рухомої фази після проходження через хроматографічну колонку λ=280 (вимірювання виконували кожні 3 мл).

Після створення графіку збирали матеріал за піками на графіку, було зібрано 4 фракції:

• фракція 1 – пробірки № 3-7, загальний об’єм – 15 мл;
• фракція 2 – пробірки № 9-12, загальний об’єм – 12 мл;
• фракція 3 – пробірки № 13-26, загальний об’єм – 42 мл;
• фракція 4 – пробірки № 35-43, загальний об’єм – 27 мл.

2.2.5. Дослідження концентрації білку після хроматографії. Концентрації білку виділених після хроматографії фракцій проводили за допомогою методу Лоурі з використанням калібрувального графіку. За даними графіку було виявлено, що фракції містять таку кількість білку:

• фракція 1 – 0,075 мг білку в 15 мл;
• фракція 2 – 0,075 мг білку в 12 мл;
• фракція 3 – 16,8 мг білку в 42 мл;
• фракція 4 –.0, 27 мг білку в 27 мл.

Ці дані свідчать про те, що загальна кількість білку після хроматографії – 17,6 мг білку, в 1,8 рази перевищує те теоретичне значення кількості білків, яку вносили до колонки. З цього можна зробити висновок, що перше застосування методу Лоурі та визначення концентрацій білків було хибним, і насправді зразок містить більшу кількість білків.

Було розраховано справжню концентрацію розчину білків, який вносили до колонки, вона становить 10,35 мг/мл. Також було розраховано загальну кількість білків, що була наявна в розчинах після діалізу, вона становить близько 1 г, що також набагато менша за теоретичне значення.

Фракцію №3, з визначеною найбільшою концентрацієювикористовували для гель-електрофорезу в поліакриламідному гелі.

2.2.6. Гель-електрофорез. Після проведення електрофорезу в 30% поліакриламідному гелі можна було чітко спостерігати 3 зони розділення. Такий результат електрофорезу свідчить про те, що в зразку наявні 3 фракції  білків з різними молекулярними масами. На жаль, не було виконано нанесення маркерного білку для електрофорезу, тому робити висновки про приблизні молекулярні маси на можна. Однак за інтенсивністю профарбовування можна сказати, що фракція білку, який має середню масу серед 3-х фракцій (лежить посередині) знаходиться в найбільших кількостях, рис 2.2.