Культивирование микроорганизмов

ЗАНЯТИЕ IV

Тема 4. Культивирование  микроорганизмов

 

Цель занятия: изучить методы культивирования и учета численности микроорганизмов

 

Содержание  занятия: 1) питательные среды; 2) приготовление питательных сред; 3) методы стерилизации; 4) техника посева и пересева культур микроорганизмов; 5) выделение чистой культуры бактерий; 6) определение качественного состава микроорганизмов по культуральным и морфологическим признакам; 7) учет численности и выделение чистой культуры микроорганизмов;

 

Материалы и  оборудование: МПБ, агар, лакмус красный, бромтимолблау, фарфоровые пластинки с лунками или чашки, стеклянные палочки, 20%-ный раствор Na₂CO₃, пробирки в штативах (для разливки агара), воронки, вата, чашки Петри, пипетки Мора на 1 мл, бумага для обертывания чашек и пипеток, колбы емкостью 250 мл, суровые нитки. Часовые стекла, шпатели, ложки, почва, стерильные колбы на 250 мл со 100 мл и стерильные пробки с 9 мл водопроводной воды, стерильные пипетки Мора на 1 мл, колбы с расплавленным МПА, стерильные чашки Петри, микроскопы и все необходимое для микроскопирования.

 

Задание

1.Познакомиться с устройствами, используемыми для стерилизации  посуды, сред, воздуха и т. д. (автоклав, сушильный шкаф, фильтры, бактерицидные лампы).

2.Подготовить для стерилизации  чашки Петри, пипетки, шпатели.

3.Подготовить для стерилизации  эрленмейеровские колбочки (емк. 100 мл) с жидкой питательной средой; закрыть ватной пробкой, бумажной салфеткой и завязать.

4.Подготовить к стерилизации  качалочные колбы  со средой  для культивирования углеводородокисляющих дрожжей: закрыть колбы ватно-марлевой салфеткой, накрыть бумажной салфеткой и завязать.

5.Подготовить для стерилизации  пробирки с водопроводной водой (9 мл).

6.Подготовить скошенный  агар (косяки) с МПА и сусло-агаром для культивирования микроорганизмов.

7. Провести посев культур  микроорганизмов (бактерий, дрожжей  и грибов) из пробирки в пробирку  с помощью бактериологической петли.

8. Провести пересев  культур бактерий и дрожжей,  выращенных на жидких питательных средах, в стерильные питательные среды.

9. Подготовить по 3 чашки  Петри с МПА и сусло-агаром.

10.Провести посев культуры микроорганизмов  (дрожжей и грибов) поверхностным способом в чашки Петри с сусло-агаром.

11.Провести посев бактериальных  культур в чашки Петри с  МПА глубинным способом.

12. Выделить чистые культуры  бактерий по методу Коха на среде МПА или сусло-агар из предоставленной суспензии культур микроорганизмов

13. Произвести количественный учет  предоставленных микроорганизмов

 

Методические указания к выполнению работы:

 

4.1. Питательные среды

В любой биологической системе  рост может быть определен как согласованное увеличение количества всех химических компонентов, как увеличение количества живого вещества. У многоклеточных организмов в процессе роста увеличиваются размеры тела, у одноклеточных - растет число клеток. Рост микроорганизмов возможен, если в окружающей среде присутствуют все необходимые питательные вещества для осуществления конструктивных и энергетических процессов клетки, источники углерода, азота, зольных элементов и микроэлементов.

Большое разнообразие метаболических процессов в клетках микроорганизмов определяет различия в их потребностях в элементах питания. Культивированием микроорганизмов называют их выращивание на искусственных питательных средах.

Одной из основных задач микробиологии является выявление численности  микроорганизмов (КОЕ — колониеобразующих единиц) в том или ином субстрате. Однако универсальной среды, на которой бы выявлялись все существующие в данном субстрате микроорганизмы, нет. Немецкий ученый Р. Кох предложил относительно универсальную среду на основе мясного бульона, на которой хорошо развиваются микроорганизмы, использующие органические азотсодержащие соединения.

Позднее С. Н. Виноградским в практику микробиологии были введены элективные, или избирательные, среды, предназначенные для определенных групп микроорганизмов. Они составлены в расчете на предельно строгие условия, при которых должен развиваться только избранный микроорганизм и никакой другой. Основной принцип элективных сред — учет избирательных потребностей микроорганизма в специфических условиях развития. Зная физиологические особенности соответствующей группы микроорганизмов, можно подобрать не только химический состав среды, но и такие условия культивирования (активную кислотность среды, условия аэрации, температуру и др.), при которых создается лабораторная имитация экологической ниши естественных условий обитания. Элективные среды позволяют осуществлять биологические процессы в лаборатории и на производстве без предварительной стерилизации среды. Примером элективных сред могут служить среды для выделения азотфиксаторов, нитрификаторов. Эти среды применяют главным образом для выделения микроорганизмов из мест их природного обитания и получения их накопительных культур.

Накопительные среды были предложены голландским ученым М. Бейеринком. В них интересующий исследователя компонент среды дается в избытке, чтобы выяснить, какой микроорганизм или группа микроорганизмов его используют, поскольку именно он или они будут доминировать в этой среде.

Оптимальные среды предложил А. А. Именецкий для целлюлозоразрушающих микроорганизмов, В. С. Буткевич — для продуцента лимонной кислоты Aspergillus niger. Основной принцип оптимальных сред заключается в создании наиболее благоприятных условий для избранных микроорганизмов внесением в среду различных стимулирующих рост добавок (витаминов, ростовых веществ, микроэлементов).

По составу среды подразделяются на две группы: естественные (натуральные) и синтетические.

Естественными обычно называют среды, которые состоят из продуктов животного или растительного происхождения, имеющих сложный неопределенный химический состав. Это — различные части растений, животные ткани, солод, дрожжи, навоз, почва, вода морей, озер и минеральных источников. Их используют чаще в виде экстрактов или настоев. На естественных средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, так как в них есть все компоненты, необходимые для роста. Однако среды с неопределенным составом малопригодны для изучения физиологии обмена веществ микроорганизмов, поскольку не позволяют учесть потребление ряда компонентов среды, а также выяснить, какие вещества образуют микроорганизмы. Указанные недостатки связаны с тем, что состав естественных сред очень сложен и непостоянен, так как существенно колеблется в зависимости от вида сырья и способа приготовления. Это заметно влияет на рост микроорганизмов. Естественные среды используют главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и диагностических целей.

Синтетические — это такие среды, в состав которых входят в точно указанных концентрациях только известные химически чистые соединения. Синтетические среды бывают простыми и достаточно сложными по составу. Их широко используют для исследований, связанных с изучением обмена веществ микроорганизмов.

Существуют и так  называемые полусинтетические среды, относящиеся к средам с неопределенным составом. В них наряду с соединениями известной химической природы входят вещества неопределенного состава. Например, в мясной бульон наряду со сложными и неопределенными по химическому составу веществами (мясной бульон) могут входить пептон, глюкоза или сахароза, поваренная соль, фосфат калия; картофельные среды содержат глюкозу и пептон. Полусинтетические среды широко используют в микробиологической практике для получения витаминов, антибиотиков, аминокислот и других продуктов жизнедеятельности микроорганизмов.

Питательные среды могут  быть различной консистенции: жидкие, плотные, полужидкие.

Плотные питательные среды используют для учета количества бактерий, выделения чистой культуры и других целей. Такие среды готовят из жидких, добавляя 1,5—2,5% агара или 10—15% желатины. При приготовлении полужидких сред вносят 0,1—0,2% агара.

Агар — это растительный коллоид, получаемый из некоторых морских водорослей. В его состав входят главным образом полисахариды, а также ничтожное количество азотистых веществ. Выпускают агар в виде пластин, стебельков, порошка. Большинство микроорганизмов не используют его в качестве субстрата, и поэтому агар удобен как инертный уплотнитель среды. Температура плавления агара — 100 °С, затвердевания — 40 °С.

Желатина — кислый азотсодержащий продукт, добываемый при выварке костей, хрящей, сухожилий, чешуи рыб. Температура плавления желатины (22 — 25 °С) ниже температуры инкубации большинства микроорганизмов (30 — 37 °С). Эта особенность и способность многих микроорганизмов разжижать желатину, выделяя протеолитические ферменты, ограничивают ее применение в качестве уплотняющего средства.

Плотными питательными средами служат также гелевые пластины, введенные в микробиологическую практику С. Н. Виноградским.

Для выращивания микроорганизмов, усваивающих органические формы азота, часто употребляют мясо-пептонные среды: мясо-пептонный бульон, мясо-пептонный агар и мясо-пептонную желатину.

 

4.1.1. Приготовление  питательных сред

 

Мясо-пептонный  бульон (МПБ). Для приготовления мясо-пептонных сред используют мясной бульон, который получают следующим образом: 500 г мелко изрубленного свежего мяса без костей, жира и сухожилий заливают в эмалированной кастрюле 1 л водопроводной воды, нагретой до 50 °С, и оставляют настаиваться 12 ч при комнатной температуре или 1 ч при 50—55 °С. Мясо отжимают, экстракт процеживают через марлю со слоем ваты, кипятят 30 мин для свертывания коллоидных белков и фильтруют дважды (первый раз через марлю с ватой, второй — через бумажный фильтр). Фильтрат доливают водой до 1 л, разливают в колбы, закрывают ватными пробками и стерилизуют при 120 °С 20 мин. (пробки колб закрывают сверху колпачками из бумаги). Ватные пробки должны быть плотными, так как они служат фильтром, препятствующим проникновению бактерий из воздуха после стерилизации.

Мясной бульон может  быть использован в любое время  для приготовления соответствующих  сред. Если их готовят сразу, то предварительная стерилизация мясного бульона не требуется.

Нередко в лабораторных условиях мясной настой кипятят вместе с мясом, затем мясо отжимают. При этом бульон получается хорошего качества. При потребности в мясном бульоне особо высокой питательности во время настаивания мяса с водой добавляют немного пепсина и подкисляют бульон соляной кислотой. Пепсин способствует дополнительной гидролизации белковых соединений мяса, и в результате количество доступных бактериям питательных веществ возрастает. Мясо можно заменить мясным экстрактом (5 г на 1 л среды).

Для приготовления МПБ  к 1 л мясного бульона добавляют 5—10 г пептона (первый продукт гидролиза белка) для повышения калорийности среды и 5 г поваренной соли для создания осмотической активности. Среду нагревают до растворения пептона, постоянно помешивая.

Затем устанавливают  нейтральную или слабощелочную  реакцию среды, приливая 20%-ный раствор Na₂CO₃ до посинения влажной красной лакмусовой бумажки. Для проверки рН среды удобно использовать индикатор бромтимолблау: 1 — 2 капли его смешивают в фарфоровой чашке с каплей бульона. В нейтральной среде бромтимолблау — бутылочно-зеленый, в кислой — желтый, в щелочной — синий.

После установления рН среду  снова кипятят 5—10 мин, и белки, свернувшиеся при изменении реакции среды, отфильтровывают через бумажный фильтр без осветления бульона или осветлив его белком. Для этого свежий яичный белок взбивают с двойным по объему количеством воды и смешивают с охлажденным до 50 °С бульоном. Смесь кипятят, помешивая, на слабом огне 10 мин, затем фильтруют. Прозрачный мясо-пептонный бульон разливают в пробирки, закрывают ватными пробками и стерилизуют при 120 °С 20 мин.

Мясо-пептонный  агар (МПА). К 1 л МПБ добавляют 15— 20 г агара. Среду нагревают до растворения агара (температура его плавления — 100 °С, затвердевания — 40 °С), устанавливают слабощелочную реакцию среды 20%-ным раствором Na₂CO₃ и через воронку разливают в пробирки (приблизительно по 10 мл агара столбиком для последующего разлива по чашкам Петри и по 5 мл для получения скошенного агара — косяков).

При разливе агара  необходимо следить за тем, чтобы  края пробирок оставались сухими, иначе  пробки прилипнут к стеклу. Пробирки со средой стерилизуют в автоклаве  при 120 °С 20 мин.

Мясо-пептонная  желатина (МПЖ). В 1 л МПБ помещают 100—150 г желатины. Температура плавления желатины зависит от ее содержания в среде: в случае 10%-ной концентрации в среде она плавится при 24 °С; в случае 15%-ной — при 25°С. В летнее время среды готовят, добавляя 15% желатины.После растворения желатины при осторожном нагревании устанавливают слабощелочную реакцию среды (как для МПБ и МПА), кипятят 5 мин, затем охлаждают до 40—50 °С. Взбитый с небольшим количеством воды яичный белок вливают в охлажденную желатиновую среду, хорошо взбалтывают и снова нагревают. Среда после выпадения белков в осадок становится прозрачной. Ее фильтруют в горячем виде через бумажный фильтр, разливают в пробирки и стерилизуют в кипятильнике Коха текучим паром, прогревая среду 3 раза по 30 мин каждые 24 ч.

Картофельный  агар. Нарезают ломтиками 200 г очищенного и промытого водой картофеля, заливают 1 л водопроводной воды, варят 30 мин. Отвар фильтруют через вату и добавляют воду до первоначального объема. К полученной жидкости прибавляют 2% агара, кипятят до его расплавления и устанавливают нейтральную, реакцию среды (рН = 7). Среду стерилизуют 20 мин при 1 атм.(По системе СИ давление принято выражать в паскалях (Па): 1 атм = 1,01325 х 10⁵ Па = 0,1 МПа)