Культивирование микроорганизмов

Консистенция  колонии - маслянистая, тестообразная, вязкая, плёнчатая.

Структура колоний (однородная, мелко- или крупнозернистая, радиально или концентрически исчерченная, мучнистая, пленчатая, врастающая в агар, легко снимающаяся иглой с агара);

При развитии культуры на жидких средах отмечают: характер развития пленки (тонкая, сухая, складчатая, слизистая) и ее цвет; наличие мути (слабая, умеренная, сильная); присутствие, характер осадка (обильный, плотный, хлопьевидный) и его цвет.

При посеве уколом, когда  иглу с культурой вводят в столбик  агара, отмечают интенсивность роста в верхней, средней или нижней частях укола. При изучении колоний актиномицетов обращают особое внимание на пигмент, выделяемый в среду, окраску воздушного и субстратного мицелия. Значение имеет структура и консистенция колоний (плотная, кожистая, порошковидная, рыхлая), поверхность колоний (мучнистая, пушистая, бархатистая) и запах колоний (землистый, эфирный, фруктовый).

Рис. 10. Профиль колоний  микроорганизмов:

а — изогнутый; б — кратеровидный; в — бугристый; г — врастающий в агар; д — плоский; г — выпуклый; ж — каплевидный; з — конусовидный

Для описания колоний  из имеющихся чашек Петри берут ту, на которой колонии достаточно изолированы друг от друга. В отобранной чашке выбирают хорошо изолированные и различающиеся внешним видом колонии, которые описывают, указав все характерные признаки их роста.

Из отобранных колоний  приготавливают препараты, микроскопируют для проверки морфологической однородности клеток. При приготовлении препаратов необходимо соблюдать все правила стерильности (не открывать широко крышку чашки, хорошо простерилизовать петлю). Далее пересевают культуру из колонии в пробирку со скошенной плотной питательной средой (косяк).

Посев проводят следующим  образом.

1. Зажимают пробирку  средним пальцем левой руки (скошенная  поверхность агара должна быть обращена вверх).

2. Обжигают петлю.

3. Приоткрывают крышку  чашки Петри, берут петлей материал  из колонии и закрывают крышку.

4. Быстро делают посев  штрихом по поверхности косого агара.

5. Делают на пробирке  надпись, число, номер колонии и др., и ставят посев в термостат.

Для выделения чистых культур многих бактерий используют МПА, для дрожжей - сусло-агар.

Недостатком этого метода является то, что иногда получаются не чистые, а смешанные культуры. Это является результатом того, что колонии могут образоваться не из одной, а из двух или нескольких клеток, попавших в одну точку. Поэтому этот метод выделения чистых культур требует двух- или трехкратного повторения выделения культур из одной колонии. Для этого готовят суспензии культур микроорганизмов изолированных колоний в стерильной водопроводной воде. Из каждой суспензии стерильной пипеткой делают разведение в стерильной водопроводной воде (1 капля суспензии на 8-10 мл воды) и взвесь микроорганизмов рассевают на поверхность плотной питательной среды в чашки Петри, которые помещают на 3 — 4 суток в термостат.

Через 3 - 4 суток просматривают  выросшие колонии и сверяют их признаки с отмеченными признаками при выделении культуры.

Однородность колоний  и совпадение признаков с описанными ранее свидетельствуют о чистоте культуры.

Изолированные колонии  рассевают в две пробирки на поверхность  скошенной питательной агаризованной  среды и помещают в термостат  при определенной температуре, благоприятной для данного микроорганизма, на 2-3 суток.

 

4.5. Определение качественного состава микроорганизмов по культуральным и морфологическим признакам

 

Из каждой группы колоний, выросших на плотных средах, готовят препарат и определяют по форме клеток, к какому роду микроорганизмов они относятся.

Из общего числа микроорганизмов, развивающихся на МПА, можно выделить следующие роды: Pseudomonas, Flavobacterium, Bacillus, Micrococcus, Sarcina, Mycobacterium, Actinomyces.

Род Pseudomonas. На МПА микроорганизмы этого рода формируют колонии: круглые, неправильной формы, плоские и выпуклые, слизистые и пастообразные, просвечивающие, бесцветные или пигментированные (грязно-белые, синие, сине-зеленые, красные, желтые, бурые и черные).

 Характерная особенность представителей рода — образование сине-зеленого или желто-зеленого флуоресцирующего пигмента. Некоторые колонии удается наблюдать только в ультрафиолетовых лучах. У других видов пигменты диффундируют в среду, окрашивая ее в соответствующий цвет. Образование определенного пигмента зависит от состава и реакции среды.

Клетки Pseudomonas прямые или слегка изогнутые, часто с заостренными концами. Они располагаются одиночно, парами или короткими цепочками. Размеры клеток 1,5 —4x0,5 — 1 мкм. Двигаются эти организмы при помощи жгутиков (монотрихи или лофотрихи), не образуют чехлов; для них неизвестны стадии покоя. Бактерии Pseudomonas — аэробы, но в анаэробных условиях способны использовать для дыхания кислород нитратов. Клетки грамотрицательные.

Род Flavobacterium. На МПА дают выпуклые или слабо выпуклые округлые колонии диаметром 2 — 3 мм с цельным краем, чаще гладкие и блестящие, прозрачные, желтого цвета за счет каротиноидных пигментов, не диффундирующих в среду, встречаются желтовато-оранжевые колонии, иногда и красные.

Клетки палочковидной  формы (0,5х 1,0—3,0 мкм) с закругленными концами, неподвижны. Располагаются флавобактерии одиночно, парами и в виде коротких цепочек, иногда — в виде нити. Характерен защелкивающийся тип деления, или снэпинг-тип обособления делящихся клеток. Эндоспор не образуют. Грамотрицательные.

Род Micrococcus. На МПА, как правило, образуют колонии мелких и средних размеров (диаметр 2—4 мкм). Колонии могут быть: матовые, блестящие, маслянистые; гладкие, выпуклые, плоские; зернистые, мелкоскладчатые; пастообразной или слизистой консистенции, иногда встречаются сухие плотные; цвет колоний возможен белый, серый, реже колонии бесцветные, встречаются буроватые, обычно — желтые, розовые или красные. Пигменты в среду не диффундируют. Клетки мелкие (диаметр 0,2—1,5 мкм), одиночные, могут встречаться пары, тетрады или скопления неправильной формы. Клетки неподвижные, не образуют эндоспор. Грамположительные.

Род Sarcina. Колонии средних размеров; круглые, компактные, выпуклые, плоские; гладкие, бугристые или складчатые, зернистой структуры; матовые или жирно-блестящие; желтые, лимонно-желтые, иногда розовые, красные, белые. Клетки сферические (диаметр 1,8—3 мкм), соединены в пакеты. Пакет объемный — куб, состоит из 8 клеток, поскольку образуется при делении клетки в трех взаимно перпендикулярных плоскостях. Под микроскопом пакет выглядит состоящим из четырех клеток (одна сторона куба). Есть сарцины, у которых пакеты уложены упорядочение по четыре, и под микроскопом они смотрятся как большие тюки, состоящие из четырех пакетов (Рис. 9 к).

 Род Mycobacterium. Относится  к группе микобактерии. На МПА микобактерии растут медленно или очень медленно. Они образуют мелкие, круглые компактные колонии, иногда приподнятые; мягкие, пастообразной или слизистой консистенции (растекающиеся по субстрату), бывают сухие крошащиеся, бугристые складчатые; матовые, блестящие, бесцветные или окрашенные (розовые, оранжевые, желтые, зеленые, синие, бурые, черные). Пигмент в среду не выделяют. Молодые клетки — ветвистые или угловатые с неправильными контурами (3,0—7,0x0,7 мкм); с возрастом у большинства видов клетки распадаются на кокки и палочки. Обособление делящихся клеток происходит по снэпинг-типу. Большинство видов грамположительные.

Род Bacillus. Палочковидные бактерии, способные образовывать более или менее термоустойчивые споры. Во время формирования споры палочковидная форма клеток сохраняется. По характеру роста колоний на МПА (или МПА + сусло-агар) можно иногда определить видовую принадлежность бацилл. Клетки грамположительные. Аэробы.

В. megaterium — земляная палочка (от лат. terra — земля, почва). Колонии гладкие, белые, выпуклые, жирно-блестящие, редко — складчатые (Рис. 11, а); края колоний резко очерчены или волнисто-бахромчатые. Споры овальные или цилиндрические, не шире материнской клетки, в поперечнике достигают 2 мкм. Длина клеток — 5—7 мкм и более (Рис. 11, б).

В. subtilis (от лат. sub — внутри или под, tilia — липа, трава, луб; впервые выделена из сена) — сенная палочка. Колонии сухие мелко морщинистые,бархатистые; бесцветные или розовые; срастающиеся с агаром; край колоний волнистый или слегка волнистый. Палочки короткие тонкие — 3—5x0,9 мкм. Споры овальные (0,9^х0,6 мкм), расположены не строго центрально, на некоторых средах — ближе к центру. Клетки подвижные (перитрихи).

В. mesentericus — картофельная палочка. Название связано не с картофелем, а с картофельной болезнью хлеба, которую она вызывает. Появляется картофельная палочка на качественном пшеничном хлебе (зерновом, барвихинском) при хранении его в течение нескольких дней в теплом месте при повышенной влажности, вызывая разрушение белковых веществ и крахмала. При ее интенсивном развитии внешние признаки мякиша изменяются: при разломе он становится тягучим и липким, появляется затхлогнилостный, иногда с примесью сладковатого, запах. Колонии на МПА тонкие, сухие, морщинистые, серовато-белые. Палочки тонкие, длинные и короткие; подвижные (3 — 10x0,5 — 0,6 мкм); иногда они соединены в длинные нити. Споры овальные и продолговатые (0,9 — 0,5 мкм). При формировании спор клетки не меняют палочковидной формы. Прорастание спор экваториальное.

Рис. 11. Bacillus megaterium:

а — колонии на МПА; б — клетки двухсуточной культуры на МПА

В. mycoides — грибовидная палочка. Образует колонии, напоминающие рост гриба: ризоидные или мицелевидные, стелющиеся по поверхности агара. Пучки нитей отходят от края колоний, создавая иллюзию ветвления; нити изгибаются направо или налево, образуя право- или левовращающиеся формы колоний. Клетки в поперечнике — 0,8—1,2 мкм, по длине в зависимости от среды — 5—7 мкм, часто 10 мкм и более (Рис. 12). Цитоплазма вакуолизирована, с гранулами запасных питательных веществ. Формы подвижные (перитрихи). Вид имеет много вариантов. Клетки грамположительные.

 

Рис. 12. Bacillus mycoides:

а — колонии на МПА; б — клетки трехсуточной культуры на МПА

В. cereus (от лат. сега — восковой) — колонии восковидные, толстые, компактные, матовые со складчатым центром и ризоидными волнистыми краями; иногда мелкобугристые, с бахромчатыми краями, от которых отходят тонкие сплетения нитей. Клетки толстые, диаметром 1 — 1,5 мкм, длиной 3— 5 мкм, иногда и более; одиночные или соединены в цепочки, нити. Споры овальные (1,2— 1,5x0,9 мкм), расположены субтерминально, прорастают полярно.

В. idosus (от лат. idos — образ, вид) — колонии сухие, матовые, плоские, мелкоморщинистые, легко и целиком снимающиеся иглой с поверхности агара. Клетки — тонкие прямые палочки (2—3x0,6 мкм), подвижные. Споры овальные, чаще образуются в центральной части клеток.

Род Actinomyces — лучистые грибы. Зрелые колонии (7—14 сут) обычно шероховатые, рыхлые по текстуре, могут быть бугристые, складчатые, бородавчатые с мучнистым налетом; разных оттенков; срастаются с субстратом и состоят из несептированных ветвящихся нитей длиной 10 — 50 мкм.

 

4.6. Учет численности  и выделение чистой культуры  микроорганизмов

4.6.1. Методы  учета численности микроорганизмов

4.6.1.1. Учет численности  микроорганизмов (КОЕ) в почве  методом питательных пластин  в сочетании с методом последовательных разведений

 

Почва — наиболее благоприятная  среда для развития микроорганизмов.

В связи с большой  гетерогенностью ее состава для  учета численности в ней микроорганизмов с исследуемого участка берут среднюю почвенную пробу .

Сначала готовят суспензии (методом разведения), содержащие разные концентрации почвы в 1 мл воды. Для этого на стерильное часовое стекло стерильным фарфоровым шпателем или алюминиевой чайной ложкой берут из банки или мешка навеску почвы в 1 г. Часовое стекло, шпатель, ложку фламбируют в пламени горелки или, смочив в спирте, обжигают. При взвешивании почвы часовое стекло накрывают другим стерильным часовым стеклом.

Навеску почвы, соблюдая условия асептики, переносят в  колбу на 250 мл с 99 мл стерильной воды. Смесь взбалтывают 5 мин, не смачивая пробку. Стерильной пипеткой берут 1 мл суспензии, содержащей 10~² г почвы, и переносят в пробирку с 9 мл стерильной водопроводной воды. Пипетку неоднократно промывают водой в пробирке, чтобы максимально смыть клетки с ее стенок. Другой стерильной пипеткой берут из колбы еще 1 мл суспензии и помещают во вторую колбу, также содержащую 99 мл стерильной водопроводной воды. Эту пипетку промывают таким же образом, как и в первом случае. Пробирку и вторую колбу взбалтывают 1 мин. Концентрация почвы в пробирке будет 10~³ г, во второй колбе — 10~⁴ г. Точно так же новыми стерильными пипетками переносят по 1 мл суспензии из второй колбы во вторую пробирку с 9 мл и в третью колбу с 99 мл стерильной водопроводной воды и готовят новые суспензии, содержащие в 1 мл соответственно 10~⁵ и 10~⁶ г почвы. Для определения численности микроорганизмов в каждом разведении методом питательных пластин можно провести глубинный или поверхностный посев. Последний более сложен и занимает больше времени. Поэтому для подсчета численности бактерий в почве методом питательных пластин можно ограничиться глубинным посевом, а поверхностный использовать при учете численности различных физиологических групп микроорганизмов на плотных средах.

Для определения количества живых клеток, содержащихся в 1 мл суспензии каждого разведения, берут по 1 мл этих суспензий и переносят в стерильные чашки Петри, используя всякий раз новую стерильную пипетку (лучше пипетку Мора). На крышках чашек стеклографом отмечают исследуемый вариант и разведение. Затем в чашки Петри вливают расплавленный МПА, заранее приготовленный и разлитый в пробирки на 20 мл (²/з объема) из расчета одна пробирка на чашку. Температура агара должна быть примерно 45 °С. Ее определяют, прикладывая пробирку с расплавленным агаром к щеке: если щеке не горячо — среду можно вылить в чашку Петри. Осторожными круговыми движениями чашки, не смачивая крышку, агар перемешивают с суспензией. Чашки с застывшим агаром переворачивают вверх дном, чтобы избежать попадания на его поверхность конденсационной влаги с крышки, и помещают в термостат при 28—30 °С.

Клетки микроорганизмов, попав в питательную среду, начинают размножаться и образуют видимые  невооруженным глазом колонии. Каждая колония на чашке с питательной средой вырастает из одной колониеобразующей единицы (КОЕ), которая может представлять собой бактериальную, дрожжевую клетку, спору, кусочек мицелия актиномицета или гриба. Через 48 ч инкубации чашки вынимают из термостата и предварительно подсчитывают число колоний. В связи с тем что существуют медленнорастущие формы бактерий, окончательный подсчет делают на 5-е сут.