Культивирование микроорганизмов

- Берут в правую  руку бактериологическую петлю,  с помощью которой осуществляют посев (петлю держат как карандаш).

- Стерилизуют бактериологическую петлю в пламени горелки, прокаливая проволоку докрасна, и одновременно обжигают примыкающую к петле часть держателя, который будет вводиться в пробирку с культурой микроорганизмов. При прокаливании петлю держат в пламени почти вертикально, чтобы вся проволока была раскалена.

- Берут в левую руку  две пробирки - одну со стерильной средой (дальше от себя), другую - с культурой микроорганизмов (ближе к себе).

- Не выпуская бактериологической  петли в правой руке, мизинцем  и безымянным пальцем правой руки прижимают наружные концы ватных пробок к ладони и вынимают пробки из пробирок. Класть пробки на стол нельзя.

- Слегка обжигают в  пламени горелки края открытых  пробирок.

- Вводят в пробирку  с культурой микроорганизмов  петлю. Чтобы не повредить клетки  микроорганизмов,  петлю  вначале охлаждают, прикасаясь к внутренней поверхности пробирки или к питательной среде, свободной от клеток микроорганизмов, и только после этого отбирают небольшое количество микробной массы.

- Вынимают петлю и  вводят ее в пробирку со стерильной питательной средой, избегая прикосновения со стенками пробирки.

- Проводят петлей от  дна вверх зигзагообразную или  прямую черту-штрих, слегка касаясь  поверхности агара.

- Обжигают ватные пробки  и края пробирок одновременно в пламени и закрывают обе пробирки.

- Обжигают петлю в  пламени.

 

4.3.2. Пересев  культур микроорганизмов, выращенных в жидкой среде

 

- Из стерильной бумаги вынимают градуированную стерильную пипетку за верхний конец, берут пипетку средним и большим пальцами правой руки,

не касаясь поверхности  той части пипетки, которая будет  вводиться в сосуд с жидкой средой.

- Берут в левую руку  пробирку (или колбу) с культурой микроорганизмов, выращенной в жидкой среде, и держат ее в вертикальном положении, чтобы не замочить пробку.

- Открывают пробку, соблюдая  все правила стерильности, описанные выше, и вводят пипетку в пробирку.

- Набирают в пипетку  суспензию микроорганизмов, закрывают пробкой пробирку (или колбу), вносят определенное количество суспензии в свежую стерильную питательную среду, соблюдая уже описанные правила предосторожности.

- Пипетку помещают  в сосуд с дезинфицирующим  раствором (0,5 — 3% водным раствором хлорамина или 3 — 5% водным раствором фенола), не касаясь ею окружающих предметов.

 

4.3.3. Посев на  плотные среды в чашки Петри

Посев в чашки Петри  проводится несколькими способами.

Поверхностный способ посева:

- Готовят в чашках  Петри твердые пластинки из  питательной среды. Стерильную твердую питательную среду расплавляют на водяной бане в пробирке или колбе и охлаждают до 50° С.

- Вынимают чашки Петри  из бумаги, в которой они стерилизовались,  и ставят их на ровную горизонтальную  поверхность.

- Берут пробирку или  колбу с охлажденной до 50° С  питательной средой, вынимают ватную  пробку, обжигают на пламени горелки края пробирки и держат ее в наклонном положении.

- Приоткрывают крышку чашки  Петри левой рукой, а правой  рукой наливают среду на дно  чашки Петри, заполняя всю ее  поверхность. Оставляют чашку  Петри на столе до полного  застывания среды, затем ставят  в термостат на 15-20 мин для подсушивания.

- На твердую среду наносят  петлей или пипеткой каплю  посевного материала и затем  равномерно распределяют его  по поверхности, пользуясь стерильным  шпателем (изогнутая стеклянная  палочка).

- Шпатель вынимают из бумаги и берут в правую руку.

- Приоткрывают крышку чашки  Петри левой рукой и вносят  в нее шпатель.

- Размазывают каплю посевного  материала шпателем вращательными  движениями по поверхности агаровой  пластинки (надавливать шпателем на твердую среду не следует, так как можно ее повредить).

- Переносят шпатель в сосуд  с дезинфицирующим раствором.

 

Глубинный способ посева:

- Приоткрывают стерильную чашку  Петри и помещают петлей или  пипеткой каплю посевного материала  на дно чашки.

- Расплавляют агаризованную  питательную среду в пробирке  или колбе и охлаждают ее  до 45-18° С.

Обжигают края пробирки или колбы в пламени горелки  и выливают среду в чашку Петри  с внесенным посевным материалом, соблюдая правила стерильной работы.

- Распределяют равномерно посевной материал в питательной среде, для чего осторожно круговыми движениями перемещают чашку Петри по поверхности стола.

Оставляют чашку Петри  на столе до полного застывания среды. Делают на чашке Петри надпись (число, название микроорганизма). Все посевы, выполненные описанными способами, помещают в термостат для выращивания микроорганизмов при температуре, благоприятной для их роста.

 

4.4. Выделение  чистой культуры бактерий

 

В микробиологической практике широко используются как чистые культуры микроорганизмов, так и консорциумы.

Консорциумы - смешанные или ассоциативные культуры, состоящие из 2-х и более микроорганизмов, между которыми существуют различные формы взаимоотношений. При изучении физиолого-биохимических особенностей и цикла развития бактерий, а также для установления их видовой принадлежности необходимо работать с чистой культурой микроорганизмов. Чистой культурой называют культуру, состоящую из микроорганизмов одного вида. Чистая культура микроорганизмов, которая является потомством одной единственной клетки, называется клоном.

Выделение чистой культуры включает три этапа: получение накопительной культуры, выделение чистой культуры, определение ее чистоты.

Для получения накопительной культуры определенного вида бактерий сначала подбирают элективные (избирательные) условия среды, обеспечивающие преимущественное развитие данных бактерий. Затем из мест обитания, в которых преобладают представители данной группы, делают посев на соответствующую элективную (селективную) среду.

Чистую культуру получают из одной клетки или отдельной колонии накопительной культуры. Во втором случае из накопительной культуры после ее разведения делают высев на плотную среду по методу Коха. Каждую образовавшуюся колонию считают развившейся из одной клетки.

Для выделения из накопительной культуры чистых культур аэробных бактерий делают высев на чашки Петри: каплю соответствующего разведения осторожно размазывают стерильным стеклянным шпателем по поверхности плотной среды, после чего этим же шпателем протирают поверхность последующих 3 — 4 чашек. Чашки выдерживают в термостате от 2 до 7 сут, так как скорость роста различных микроорганизмов неодинакова. Выросшие на некотором отдалении от других колонии отсевают петлей в пробирки на поверхность скошенной плотной среды или в жидкую среду.

Высев из накопительной  культуры микроорганизмов, относящихся  к факультативным аэробам или факультативным анаэробам, для получения изолированных колоний делают методом глубинного посева в пробирки со столбиком стерильного агара. Для этого стерильной иглой берут чистую культуру из колоний, одновременно вынимают пробку, обжигают края пробирки, держа ее вверх дном, и над горелкой делают иглой прокол до дна.

Выделение чистой культуры анаэробных бактерий по методу Коха возможно только при ограничении доступа кислорода, в частности при инкубации в анаэростате.

Чистоту культуры определяют микроскопированием препарата.

Существует несколько  методов получения чистых культур. Все они основаны на выделении  из популяции одной клетки.

Метод разбавлении Пастера. Из суспензии, содержащей смесь микроорганизмов, делается ряд последовательных разведении в стерильной жидкой питательной среде. С каждым разведением количество микроорганизмов, попадающих в пробирку, будет уменьшаться и можно таким образом получить такие разведения, когда в объеме среды в пробирке будет находиться только одна клетка, из которой и разовьется чистая культура. Однако этот метод не всегда дает возможность получить чистую культуру и в настоящее время практически мало используется.

Выделение чистой культуры из одной клетки капельным методом. Предварительно подготавливается разведение культуры микроорганизма в питательной среде с таким расчетом, чтобы в небольшой капле этой среды могли быть единичные клетки. Затем на поверхность стерильного стекла с помощью простерилизованной иглы и стеклянной палочки наносят ряды мелких капель среды, содержащей микроорганизмы. Стекло перевертывают и помещают над лункой предметного стекла. Края лунки предварительно обмазывают вазелином. Затем все капли просматривают под микроскопом и отмечают те из них, в которых находится только одна клетка.

Стекло помещают в  чашку Петри, на дне которой находится увлажненная фильтровальная бумага, и ставят в термостат; клетка размножается, образуя микроскопическую колонию.

Полученную колонию  снимают стерильной фильтровальной бумагой, которую держат простерилизованным на пламени пинцетом, и переносят в пробирку с питательной средой.Выделение чистой культуры капельным методом используется при работе с крупными микроорганизмами (дрожжи, плесени).

Выделение чистой культуры с помощью микроманипулятора. Для выделения под контролем микроскопа одиночных микробных клеток и их посева применяют специально оборудованные микроскопы - микроманипуляторы. Отдельные микробные клетки в них вылавливаются из висячей микрокапли микропипеткой и микропетлей, перемещаемыми в поле зрения микроскопа с микронной точностью с помощью системы винтов и рычагов.

Наиболее распространен  в микробиологической практике метод выделения чистой культуры с помощью твердых сред (метод Коха).

Метод заключается в  получении чистой культуры из отдельной  колонии, выросшей на твердой питательной  среде в результате размножения  одной клетки.

Метод основан на том, что при нанесении микроорганизмов из посевного материала на твердую среду отдельные клетки будут закрепляться (иммобилизироваться) в определенной точке твердой среды и, размножаясь, давать потомство (клон), представляющее чистую культуру микроорганизма.

Для получения изолированных  колоний на твердой среде исследуемый материал высевают на поверхность твердой питательной среды, наносят петлей или пипеткой каплю исследуемого материала. Рассев проводят либо методом истощающего мазка, либо методом истощающего штриха. В первом случае шпателем равномерно распределяют нанесенную каплю по поверхности твердой среды. Тем же шпателем делают посев на поверхности второй пластинки и затем третьей, т. е. перенося последовательно на твердую среду клетки микроорганизмов, которые остались на шпателе. Таким образом, количество микроорганизмов, вносимых последовательно на пластинки, будет уменьшаться: на вторую - меньше, чем на первую; на третью - еще меньше, чем на вторую и т. д. При использовании метода истощающего штриха исследуемый материал наносят петлей в верхнюю часть твердой среды в чашке Петри и аккуратно, зигзагообразно петлей по поверхности чашки (Рис. 8.). Затем посев проводят аналогично на второй и третьей чашке. После посева чашки необходимо перевернуть вверх дном и поставить в термостат при температуре, благоприятной для данного микроорганизма. Инкубируют посевы обычно в термостате в течение 2-3 дней. В результате на поверхности среды вырастают колонии микроорганизмов.

Рис. 8. Метод посева зигзагообраз-ной петлей

 

Выросшие колонии сначала  рассматривают невооруженным глазом, а затем при помощи лупы или при малом увеличении микроскопа.

При описании колоний  микроорганизмов отмечают следующие  морфологические и культуральные  признаки (Рис. 9, 10):

Размер колоний — их диаметр в мм (10 мм и более в диаметре — крупная, от 1 до 10 — средняя, не превышает 1 мм — точечная).

Форма колоний - округлая, неправильная, мицелевидная, ризоидная, амебовидная, складчатая, концентрическая, сложная и др.

Цвет колоний — белый, желтый, розовый и т. д. и способность выделять пигмент в среду.

Рис. 9. Форма колоний микроорганизмов:

а — круглая; б — круглая с фестончатым краем; в — круглая с валиком по краю; г, д — ризоидные; е — круглая с ризоидным краем; ж — амебовидная; з — нитевидная; и — складчатая; к — неправильная; л — концентрическая; м — сложная

Поверхность колоний - гладкая, складчатая, с радиальной или концентрической исчерченностью, шероховатая, бугристая и др.

Оптические  свойства — прозрачная, полупрозрачная, непрозрачная, блестящая, матовая, флуоресцирующая и т. д.

Профиль колоний - плоский, слабовыпуклый, сильновыпуклый, вогнутый, кратерообразный и др.

Край колоний - ровный, извилистый, зубчатый, лопастной, волнистый, неправильный, реснитчатый, нитчатый, ворсинчатый, ветвистый.