Определение каталазной и пероксидазной активности в тканях высшего водного растения

 

Рис. 1.3. Схема  строения гемина и его связи с апоферментом в пероксидазе [57].

 

Феррипротопорфирин IX входит в активный центр, составляя порфириновое кольцо гемина, являющегося высокоароматичным и гидрофобным соединением. Именно гидрофобное взаимодействие порфиринового макроцикла с белком формирует третичную структуру нативной пероксидазы. Известно, что протопорфирин оказывает важное стабилизирующее влияние на белковую глобулу гемсодержащих ферментов. Так, комплексообразование апопероксидазы хрена с гемином резко повышает устойчивость белка к действию ультрафиолета и тепла. Удаление простетической группы фермента ведет к потере пероксидазной активности, но не сказывается на её оксидазной функции [31].

В составе пероксидазы  есть углеводные компоненты (рис.1.4), отщепление которых не приводит к снижению каталитической активности, но повышает устойчивость к протеолитическим ферментам.

Рис.  1.4. Составные части молекулы пероксидазы [4].

       

  Пространствненная структура пероксидазы. Фермент пероксидаза содержит в основном α-спиральные участки в составе белковой части молекулы, однако в ней также присутствует небольшая область β-складчатой структуры [79].  

В спирализованные  участки белковой молекулы входят аминокислотные остатки с номерами полипептидной  цепи А спираль – 14-28, В спираль  – 31-45, С спираль 76-90 и D спираль – 92-112. Третичная структура фермента скрепляется четырьмя дисульфидными мостиками между аминокислотными остатками: 11-91, 44-49, 97-301 и 177-209, которые расположены внутри молекулы. Центры гликозилирования пероксидазы  расположены на поверхности белка и доступны для формирования комплекса с углводами, которые включают аминокислотные последовательности состава Asp-X-Ser/Thr.

С номерами 13-15, 57-59, 158-160, 186-188, 198-200, 214-216, 268-270. Молекула пероксидазы  содержит восемь олигосахаридных цепочек.

Высказано предположение, что два иона Ca²⁺ участвующих в стабилизации трёхмерной структуры молекулы пероксидазы, координируют с аминокислотными остатками (43, 46, 48, 50,64) и (171, 222, 225, 228, 230); в координации железа гемина (Phe-41, Phe-152, His-170, Leu-250) и в связывании ароматических субстратов (Ile-180, Phe-221, Ile-244). Активный центр фермента представлен Arg-38, Phe-41, His-42. В дистальной области гемового  кармана находятся две молекулы воды.

Активную роль в каталитическом процессе пероксидазного окисления субстратов принимает участие Fe³⁺ координирующий с четырьмя атомами азотов пирролов протопорфирина проксимальным лигандом которого является остаток имидазола гистидина белка ( His-170).

В координации  гемина принимают участие остатки  фенилаланинов (Phe-41 и Phe-143), роль которых заключается в формировании гидрофобного окружения нековалентно связанного гемина и обеспечение его прочного встраивания в белковою глобулу.

Субстратсвязывающая площадка для соединений органической природы представлена протяжённой  гидрофобой областью, включающей Arg-38, Phe-142, Phe-143 [58].

 Каталитические свойства пероксидазы. Основная функция пероксидазы – катализировать окисление химических соединений за счет кислорода перекиси с образованием промежуточных комплексов, обладающих различными спектральными характеристиками. К настоящему времени обнаружено четыре типа комплексов. На рис. 1.5 представлено пять различных состояний активного центра пероксидаз растений [13].

Каталитический  цикл начинается  с взаимодействия ферри-фермента (основное состояние) и пероксида водорода с образованием так называемого соединения I (окисленное состояние), которое представляет собой оксиферрил-гем и катион-радикал на порфириновом кольце.

В ходе реакции  взаимодействия нативного фермента с пероксидом водорода при низких температурах наблюдалось образование нестабильного промежуточного соединения 0, которое является предшественником соединения I и представляет собой ферри-гидропероксидный комплекс. Другими словами, соединение I содержит два окислительных эквивалента ферри-фермента (основное состояние).

Рис. 1.5. Пять различных состояний активного центра пероксидаз растений [13].

 

Одноэлектронное восстановление соединения I электрон-донорным субстратом приводит к образованию соединения II, которое представляет собой оксиферрил-гем и содержит один окислительный эквивалент вышеуказанного ферри-фермента. Соединения I и II являются сильными окислителями; значения их редокс-потенциалов примерно равны +1 В. При одноэлектронном восстановлении соединения II фермент возвращается в нативное состояние. При взаимодействии соединения II с избытком перекиси образуется соединение III, которое также может являться продуктом некоторых других реакций. Этот интермедиат представляет собой резонансную смесь Fe(III)-супероксидного и Fe(II)-диоксидного комплексов [79].

Превращение комплекса I в комплекс II протекает быстрее в присутствии донора водорода, например полифенолов.

Комплексы II и IV представляют собой соединения, появляющиеся при избытке перекиси. Комплексы III и IV не обладают каталитической активностью, их образование ведет к торможению реакции.

Механизм действия пероксидазы напоминает реакции для трех субстратов по типу «пингпонг», где фенолы – два независимых субстрата, а перекись водорода является третьим субстратом. В результате такого типа реакций образуются свободные радикалы. Феноксильные радикалы могут появляться на двух отдельных стадиях катализа  и объединяться в димеры.  Радикалы не могут находиться в растворе в свободном состоянии, так как тогда бы они давали такие смеси продуктов, как, например, о-о-дифенол, п-п-дифенол и о-п-дифенол. Но в этих случаях присутствует только один продукт ферментативной реакции, а именно о-о-дифенол, и это свидетельствует о том, что радикалы соединяются с белком пероксидазы. Каталитический акт происходит и на поверхности белка, причем фенолы усиливают эффект модификации молекулы фермента.

Чанс и Фредович высказали предположение, что субстраты  пероксидазы можно разделить  на две  группы. Субстраты первой группы (к ним относятся в основном неорганические ионы – ферроцианид, йодид, нитрит и т. д.) взаимодействуют непосредственно с гемином. Субстраты второй группы (ароматические амины: аланин, диметилаланин, паратоллуидин и др., практически все фенолы: пирокатехин, пирогаллол, галловая кислота, бензидин, фенилендиамин, билирубин и др.) непосредственно с гемином не реагируют [4].

Пероксидаза играет большую роль в процессе дыхания  растений. Наи-более распространенными  субстратами, на которые действует  пероксидаза в тканях растений, являются полифенолы в свободном состоянии или в форме разнообразных соединений (гликозиды, дубильные вещества) и ароматические амины. Окисление тех или иных соединений пероксидаза осуществляет с помощью перекиси водорода или каких либо органических перекисей, в том числе перекиси ненасыщенных жирных кислот и каротина [70].

Присутствующий  в пероксидазе единственный ион  железа обладает способностью не только активировать перекись водорода, но и  сообщать ей способность вступать в  реакцию окисления различных  субстратов. Источником активного кислорода при каталитическом действии пероксидазы могут служить также и органические перекиси, в том числе и перекиси ненасыщенных жирных кислот и каротины.

Пероксидазы присутствуют в различных компартментах клетки: хлоропласты, митохондрии, пероксисомы, цитозоль [53].

         Роль пероксидазы в растительном организме. В настоящее время установлено, что активность изопероксидаз сильно зависит от присутствия субстратов и поэтому физиологические функции отдельных изоформ фермента значительно различаются. Пероксидаза катализирует большинство реакций, протекающих во всех типах тканей. Отмечают  видовую органогенную, тканевую  и внутриклеточную  специфичность распределения изопероксидаз.

Присутствие фермента в хлоропластах указывает на его  участие в окислительно-восстановительных реакциях в процессе фотосинтеза, а обнаружение пероксидазы в митохондриях – на участие в энергетическом обмене клетки. Значительная  пероксидазная активность определена в очищенных препаратах рибосом, фермент прочно связан с их структурой, являясь, видимо, составной частью этих органелл. Специфичный набор изопероксидаз присутствует в паренхимных клетках клубней картофеля, определяя дифференциацию этих клеток. Максимальная пероксидазная активность обнаружена в эпидермисе и сосудисто-волокнистых пучках тканей чайного растения.

На основании  цитохимических исследований пероксидазная  активность была обнаружена в цитоплазме, клеточной стенке, хромасомах и ядрышках. В молодых клетках кончиков лука наивысшая активность пероксидазы  сосредоточена в ядрах.  Это свидетельствует о возможности участии пероксидазы в специфической ядерной функции, а так как часть изоэнзимов являются щелочными белками, то не исключено, что они могут выполнять функцию, подобную функции гистонов.

Пероксидаза является индуцибельным ферментом, индукторами которого могут быть разнообразные физические, химические и биологические факторы, в том числе особого внимания заслуживают фитогормоны, как регуляторы многих физиологических процессов. Для пероксидазы доказано ее участие в образование ауксина и этилена, восстановление нитратов и нитритов, т.е. в азотном обмене, ростовых и дыхательных процессах. В присутствии пероксидазы регулируется созревание и старение тканей, а также синтез лигнина, входящего в состав клеточных стенок. Возможно, физиолого-биохимическая роль пероксидазы клеточной стенки заключается в разрушении ИУК, которая может изменять физиологическое состояние клетки.

Пероксидаза ускоряет гидроксилирование пролина, входящего  в состав клеточных стенок, что  влияет на их растяжимость, и в результате регулируется проницаемость клеточных мембран.

В составе клеточных стенок присутствуют как анодные, так и катодные формы фермента. В цитоплазме в основном выявлены катодные пероксидазы. Так, пероксидазы ГI не связана с клеточной стенкой, а ГII и ГIII обнаружены как ионосвязанными, так и ковалентносвязанными со стенкой клетки. Изопероксидазы группы ГI обладают наибольшим сродством к искусственным субстратам, а группы ГIII – к естественным. Высокое сродство к искусственным субстратам может служить основой для предположения о том, что эти пероксидазы выполняют защитную функцию, освобождая клетки от чужеродного материала. При этом большое количество изоэнзимов пероксидазы позволяет окислять самые разнообразные вещества, увеличивая физиологическую значимость этого фермента [4].

 

1.2. Влияние тяжёлых металлов на растительные организмы

         

Среди многочисленных загрязнителей окружающей среды  особое место занимают тяжелые металлы. Считается, что именно тяжелые металлы  являются наиболее токсичными для живых  организмов, в том числе для растений [7].

         К ТМ условно относят химические элементы с атомной массой свыше 50. С химической точки зрения термин «тяжелые металлы» используется для элементов, имеющих плотность более 5 г/см³ [15].

По классификации  Реймерса, тяжелыми следует считать  следующие металлы: Pb, Cu, Zn, Ni, Cd, Co, Sb, Sn, Bi, Hg. В ряде работ к ним добавляют Pt, Ag, W, Fe, Au, Mn.

Не все ТМ представляют одинаковую опасность  для растений: наиболее ядовитыми для высших растений являются Hg, Cu, Ni, Pb, Co, Cd, Ag, Bi и Sn [8, 18].

Основные источники  поступления ТМ в среду можно  разделить на природные (естественные) и техногенные. Причем нередко поступление таких металлов, как Zn, Cd, Pb, в окружающую среду, связанное с хозяйственной деятельностью человека, значительно превышает природное [49].

Главными антропогенными источниками поступления тяжёлых металлов в атмосферу являются предприятия по производству цветных металлов и сплавов, нефтепереработки, автомобильный транспорт, химическая промышленность; природные источники – пыль, лесные пожары, вулканическая деятельность, растительность, морские соли и др. [39].

          Аккумуляция растениями ТМ выше определенной величины (предельно допустимой концентрации) практически всегда отрицательно сказывается на состоянии внутренних систем организма [55] .

В большинстве  случаев уровень токсичности ТМ оценивается по выживаемости и скорости роста растений [8].

Имеются сведения, что у высших растений и водорослей системы фотосинтеза, дыхания, синтеза пигментов и белков наиболее подвержены действию ТМ. Степень угнетения процессов зависит от природы элемента и его токсичности.

Токсическое действие ионов ТМ на клетку может проявляться  по-разному: в генерации активных форм кислорода (АФК) путем вовлечения двухвалентных ионов ТМ (Pb²⁺, Cu²⁺ и др.) в реакции Фентона и реакции цикла Хабера-Вайса, в блокировании функциональных групп в молекулах белков и полинуклеотидов, а также в частичном или полном замещении атомов металла в активном центре металлосодержащих ферментов [55, 78].

В литературе описаны  различные механизмы защиты растениий  от вредного влияния избытка тяжелых металлов.

Так Серегин  и Иванов выделяют шесть внутриклеточных систем защиты, направленных на поддержание гомеостаза:

- активация  «ферментов стресса», ответственных  за нейтрализацию свободных радикалов и пероксидов (каталазы, пероксидазы, супероксиддисмутазы и др.);

- суперпродукция  осмолитов в ответ на металл  индуцированный водный стресс (пролина и др.);

- изменение  физико-химических свойств клеточных оболочек (отложении каллозы и суберина);

- синтез полиаминов (путресцина);

- изменение  гормонального баланса (прежде  всего этилена и абсцизовой кислоты);

- синтез металлсвязывающих  соединений и стрессовых белков (глутатиона, металлотионеинов, фитохелатинов и др.) [60].

По мнению большинства  авторов, все механизмы защиты действуют соответственно двум стратегиям выживания организмов при стрессовых воздействиях: или не допустить действие фактора, или обезвредить его. Так, Евсеева и др. выделяют две группы механизмов:

- ограничение  поступления металлов в растение  и цитозоль;

- изменения  метаболизма клеток, направленные  на снижение токсического действия металлов и их выведение из организма растеня.